Perle baseret Multiplex Assay for analyse af tåre cytokin profiler

Summary

Analyse af tårefilmen cytokiner hjælper i at studere forskellige okulær sygdomme. Perle baseret multiplex assays er enkle og følsomme og aktiverer afprøvning af flere mål i prøver med små mængder. Her beskriver vi en protokol for tåre filmen cytokin profilering en ved hjælp af perle baseret multiplex assay.

Abstract

Tårefilmen er en kompleks blanding af lipider, proteiner og mineraler, som dækker den udvendige overflade i øjet, hvilket giver smøring, ernæring og beskyttelse til de underliggende celler. Analyse af tårer er et nyt areal til identifikation af biomarkører for forudsigelse, diagnose og prognose af forskellige okulær sygdomme. Tårer er let tilgængelige og deres samling er ikke-invasiv. Derfor, fremrykkende teknologier vinder i forgrunden til identifikation af flere analysander i tårer at studere ændringer i protein eller en metabolit sammensætning og dets tilknytning til patologiske tilstande. Tåre cytokiner er ideelle biomarkører for at studere sundhed af okulær overflade og også hjælpe med at forstå mekanismerne af forskellige okulær overflade lidelser som tørre øjne sygdom og vernal konjunktivitis. Perle baseret multiplex assays har evnen til at opdage flere analysander i en lille mængde af prøven med en højere følsomhed. Beskriver her vi en standardiseret protokol af tåre prøvetagning, udvinding og analyse af cytokin profilering ved hjælp af en perle baseret multiplex assay.

Introduction

Tårer er produceret af lacrimal kirtel og tilbehør kirtler og pels den ydre overflade af øjet. Tårefilmen består af en ydre lipid lag og en indre vandige lag, der indeholder opløselige proteiner, Muciner og membran bundet Muciner. Tårer undgå mikrobiel invasion, leverer næringsstoffer og giver smøring til okulær overflade. Tårer fungere som forbindelsesled mellem luft og væv til ilt transport til hornhinden. ¹ tårefilmen består af proteiner, kulhydrater, lipider og elektrolytter. Association mellem tåre proteiner med okulær og systemiske sygdomme som glaukom, tørre øjne sygdom, vernal konjunktivitis, diabetes mellitus, thyreoidea-associeret orbitopathy og kræft er blevet identificeret i flere undersøgelser. ^{2 , 3 , 4} tåre prøver kan indsamles af microcapillary rør eller rive flow strimler (Schirmer strimler). Derudover er Schirmer’s test en standardprocedure, som foretages i hornhinden og refraktiv kirurgi klinikker, hvis resultater kan anvendes til cytokin analyse assays. Non-invasiv prøvetagning, tilgængelighed af bio-modellen, og sammenslutningen af tåre sammensætning med forskellige fysiologiske og patologiske betingelser gøre rive filmen en potentiel kilde til biomarkører for flere okulær og systemiske sygdomme. ^{4 , 5 , 6}

Tåre cytokiner spiller en vigtig rolle i at studere okulær overflade sundhed og betændelsestilstande i forskellige okulær sygdomme. ⁷ unormal koncentrationer af adskillige cytokiner i tåre prøver blev rapporteret at være forbundet med tørre øjne sygdom, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopisk keratoconjunctivitis (AKC), sæsonbetinget allergisk conjunctivitis og uveitis. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} tåre proteiner kan analyseres ved hjælp af traditionelle metoder som massespektrometri, western blotting og enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA). ^{14 , 15} dog begrænsninger af disse metoder er dårlig følsomhed og en større volumen af prøven kræves til analyse af flere tåre cytokiner i hver patient. ^{16 , 17} perle baseret multiplex assays er blevet udviklet til at analysere flere analysander i komplekse blanding prøver og anvendt med succes på tåre prøver at analysere flere cytokiner i forskellige sygdomme. ^{6 , 18} A kombination af sandwich ELISA og flow flowcytometri teknikker aktiverer disse assays til at blive mere følsomme end ELISA til kvantificering af flere analysander i en enkelt prøve. ¹⁹ denne metode kan anvendes på en række kliniske prøver og celle kultur analysere og hjælper i studiet af immunrespons i flere patofysiologiske forhold. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Der er flere undersøgelser, sammenligne perle baseret multiplex-undersøgelser, med ELISA og har rapporteret en sammenhæng mellem metoderne. Loo et al. sammenlignede perle baseret multiplex assay med konventionelle ELISA til påvisning af adiponectin, resistin, leptin og ghrelin i humant serum eller plasma prøver og indberettet en stærk korrelation (r > 0,9) mellem assays. ²⁵ Dupont et al. rapporterede en stærk korrelation mellem perle baseret multiplex assays og ELISA til påvisning af IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ og TNF-α i phytohemagglutinin og LPS stimuleret fuldblod indsamlet fra gravide kvinder. ²⁶ Pickering et al. rapporteret en anden stærk korrelation mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af serumantistoffer mod Haemophilus influenza type b polysaccharid (r = 0,96), Toxoider af Clostridium tetani (r = 0,96), og Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). ²⁷ Biagini et al. rapporterede en høj positiv korrelation (r = 0.852) mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprøver. ²⁸ Wang et al. rapporteret en sammenhæng mellem perle baseret multiplex assay og ELISA til påvisning af Alzheimers sygdom biomarkører amyloid-β 42 (r = 0,77), samlede tau (r = 0,94), og tau fosforyleret på aminosyre 181 (r = 0,82) i cerebrospinalvæske prøver. ²⁹ disse undersøgelser har vist anvendeligheden af perle baseret multiplex assays på forskellige kliniske prøver, mindre sample volumen krav og en korrelation med standard ELISA, som gør perle baseret multiplex assays en lovende alternativ til traditionelle ELISA metoder til påvisning af flere analysander i forskellige slags prøver i forskellige sygdom fænotyper. Her beskriver vi en standardiseret protokol for perle baseret multiplex assay for cytokin profilering for 41 analysander i tåre prøver fra raske forsøgspersoner med Schirmer strimler.

Protocol

de protokoller, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle review board Tan Tock Seng Hospital, Singapore. 1. rive cytokin analyse samling af tårer: bede emne til at sidde komfortabelt på en undersøgelse stol og placere hans/hendes hoved mod hovedstøtten. Spørger emne at slå op, omhyggeligt åbne Schirmer strimler (lavet af papirfilter Whatman nr. 41) og placere den afrundede ende af strimlen på den ringere fornix i …

Representative Results

Tåre prøver blev indsamlet fra 8 øjne af 4 raske forsøgspersoner med tåre flow strimler og cytokin niveauer blev analyseret ved hjælp af den ovenfor nævnte protokol. Alle forsøgspersoner blev mandlige og alder af de fire fag var 36, 42, 44 og 52 år henholdsvis. Okulær overflade sundhed og tørre øjne sygdom blev evalueret ved kliniske forsøg (tåre filmen bryde op tid, Schirmer’s test, cornea farvning, konjunktival farvning, låg/meibomske kirtel undersøgelse, cornea tåre te…

Discussion

Cytokiner er små cellulære udskilles proteiner og potent immunmodulatorer regulere immunrespons. ³² i udtrykket profiler af forskellige cytokiner i tåre prøver er relateret til forskellige patologiske tilstande af øjet og undersøgelser af cytokin profiler hjælpe til at forstå mekanismerne af sygdom patogenese, bestemme okulær sundhedstilstand, sygdommens sværhedsgrad, diagnose og progression. ^{2 , 5} lavere protein koncentrationer …

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair