חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

Summary

ניתוח של הסרט מדמיע ציטוקינים מסייעת בלימוד עינית מחלות שונות. מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס הינם פשוטים רגיש ולאפשר בדיקה של מטרות מרובות בדגימות עם כמויות קטנות. כאן נתאר עבור מדמיע הסרט ציטוקין פרופיל של משתמש פרוטוקול חרוז מבוסס מולטיפלקס וזמינותו.

Abstract

הסרט דמעה הוא תערובת מורכבת של שומנים, חלבונים ומינרלים אשר מכסה על המשטח החיצוני של העין, ובכך מספק שימון, הזנה והגנה של התאים המשמשים כבסיס. ניתוח של דמעות הוא אזור המתעוררים לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים עבור חיזוי, אבחון, הפרוגנוזה של מחלות שונות עינית. דמעות נגישים בקלות והוא באוסף שלהם לא פולשנית. לכן, לקידום טכנולוגיות הם צובר לגדולה עבור זיהוי של analytes מספר בדמעות ללמוד שינויים בהרכב חלבון או מטבוליט וכן את השיוך שלו עם מצבים פתולוגיים. דמעה ציטוקינים הם סמנים ביולוגיים אידיאלי ללמוד על פני השטח עינית הבריאות וגם לעזור בהבנת המנגנונים של הפרעות משטח עינית שונות כמו מחלת עין יבשה ואת האביב. חרוז המבוסס על מבחני מולטיפלקס יש את היכולת של גילוי analytes מרובים בכמות קטנה של הדגימה עם רגישות גבוהה יותר. כאן נתאר פרוטוקול מתוקננת של אוסף דגימה דמעה, חילוץ וניתוח של ציטוקין פרופיל משתמש חרוז מבוסס מולטיפלקס וזמינותו.

Introduction

דמעות מיוצרים על ידי בלוטת הדמעות ובלוטות אביזר, מעיל המשטח החיצוני של העין. דמעה הסרט מורכב רובד חיצוני השומנים ושכבה פנימית מימית הכוללת חלבונים מסיסים, mucins ממברנה שיאוגדו mucins. דמעות למנוע פלישה חיידקים, לספק חומרים מזינים וספק שימון השטח עינית. דמעות לפעול כממשק בין האוויר לבין רקמות עבור העברת החמצן בקרנית. ¹ הסרט קרע מורכב של חלבונים, פחמימות, שומנים, אלקטרוליטים. הקשר בין דמעה חלבונים עם עינית ומחלות מערכתיות כמו גלאוקומה, מחלה עין יבשה, האביב, סוכרת, orbitopathy הקשורים בלוטת התריס וסרטן זוהתה במספר מחקרים. ^{2 , 3 , 4} דגימות מדמיע יכול להיות שנאספו על ידי צינורות microcapillary או דמעה זרימה רצועות (Schirmer רצועות). בנוסף, המבחן של Schirmer הוא נוהל שגרתי שבוצעה קרנית, ניתוח לתיקון הראייה בלייזר במרפאות, התוצאות אשר עשוי לשמש ציטוקין ניתוח מבחני. אוסף דגימה לא פולשנית, נגישות של הדגימה הביו והאגודה הקומפוזיציה מדמיע במגוון מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים להפוך קורעים סרט מקור פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים עבור כמה מחלות עינית ומערכתית. ^{4 , 5 , 6}

דמעה ציטוקינים ממלא תפקיד חשוב ללמוד את עינית משטח ובריאות במצבים דלקתיים במחלות שונות עינית. ⁷ ריכוזים חריגים של ציטוקינים מספר הדגימות מדמיע דווחו להיות מזוהה עם מחלת עיניים יבשות, סולט לייק סיטי keratoconjunctivitis (VKC), keratoconjunctivitis אטופית (AKC), דלקת הלחמית אלרגית עונתית של uveitis. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} חלבונים מדמיע ניתן לנתח אותם באמצעות שיטות מסורתיות כמו ספקטרומטר מסה, סופג המערבי, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). ^{14 , 15} . עם זאת, המגבלות של שיטות אלה הן רגישות המסכן נפח גדול יותר של מדגם הנדרש לניתוח של ציטוקינים מדמיע מרובים של כל מטופל. ^{16 , 17} חרוז המבוסס על מבחני מולטיפלקס יש פותחה כדי לנתח analytes מרובים בדגימות תערובת מורכבת, הוחלו בהצלחה על דגימות מדמיע כדי לנתח ציטוקינים מרובים במחלות שונות. ^{6 , 18} א’ שילוב של כריך אליסה וטכניקות cytometry זרימה מאפשרים אלה מבחני להיות רגיש יותר אליסה עבור כימות של analytes מרובים בדוגמה אחת. ¹⁹ בשיטה זו ניתן להחיל על מגוון של דוגמאות קליניות, supernatants התרבות תאים ומסייע במחקר של התגובות החיסון מספר תנאים הקשורים pathophysiological. ^{20 , 21 , 22 , 23 , 24}

ישנם מספר מחקרים בהשוואת מולטיפלקס חרוז המבוסס על מבחני עם אליסה, דיווחו על מתאם בין השיטות. חרוז. et al. בהשוואה loo מבוסס assay מולטיפלקס עם אליסה קונבנציונליים עבור הגילוי של אדיפונקטין, resistin, לפטין, גרלין בדגימות סרום או פלזמה האנושי ודיווח מתאם חזק (r > 0.9) בין מבחני. ²⁵ דיווחו דופונט. et al. מתאם חזק בין מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס ואליסה איתור IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ ו- TNF-α phytohemagglutinin ו ליפופוליסכריד המרצת דם אסף מנשים הרות. ²⁶ . פיקרינג et al. דיווח אחר מתאם חזק בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה לאיתור נוגדנים בסרום Haemophilus שפעת סוג b רב-סוכר (r = 0.96), toxoids של Clostridium tetani (r = 0.96), ו- Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). ²⁷ . Biagini et al. דיווח על מתאם חיובי גבוה (r = 0.852) בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה גילוי של Bacillus anthracis אנטי-PA IgG בסרום הדגימות. ²⁸ . וואנג et al. דיווח על מתאם בין חרוז מבוסס assay מולטיפלקס ואליסה איתור של מחלת אלצהיימר סמנים ביולוגיים עמילואיד-β 42 (r = 0.77), הכולל טאו (r = 0.94), טאו phosphorylated-חומצת אמינו 181 (r = 0.82) ב . דגימות נוזל מוחי שדרתי ²⁹ מחקרים אלו הוכיחו שהישימות של חרוז סמך מבחני מולטיפלקס מגוון של דוגמאות קליניות, דרישות האחסון מדגם קטן יותר קשר עם אליסה סטנדרטי, ההופכים את מבחני מולטיפלקס חרוז המבוסס על התחלה מבטיחה. חלופה לשיטות אליסה מסורתי איתור analytes מרובים בסוג שונה של דוגמאות פנוטיפים מחלות שונות. כאן נתאר עבור assay מולטיפלקס חרוז המבוסס על ציטוקין פרופיל עבור analytes 41 מדמיע הדגימות שנאספו מן הנבדקים בריא באמצעות רצועות Schirmer פרוטוקול סטנדרטית.

Protocol

בפרוטוקולים המשמשים במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של החולים סנג טוק טאן, סינגפור. 1-ניתוח ציטוקין לקרוע אוסף של דמעות: לשאול את הנושא כדי לשבת בנוחיות על כיסא הבדיקה מקום הראש כנגד משענת הראש. שאל את הנושא לחפש בקפידה לפתוח את רצועות Schirmer (…

Representative Results

דמעה דגימות נאספו מעיני 8 4 נושאים בריא באמצעות רצועות זרימה דמעה, רמות ציטוקינים נותחו באמצעות פרוטוקול שהוזכרו לעיל. כל הנבדקים היו זכר והיה הגיל של הנושאים ארבע שנים 36, 42, 44, 52 בהתאמה. עין יבשה ובריאות משטח עינית המחלה הוערך על ידי מבחנים קליניים (מדמיע מעבר הסרט את הזמן, ?…

Discussion

ציטוקינים הם החלבונים המופרש קטנה חזק מאפננים המערכת החיסונית ויסות תגובות מערכת החיסון. ³² את פרופילי ביטוי של ציטוקינים שונים בדמעה דגימות קשורות לתנאים פתולוגיים שונים של העין, מחקרים על ציטוקין פרופילים לעזור להבין את מנגנוני פתוגנזה המחלה, לקבוע את המצב של בריאות עינית, …

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit	Merck, USA	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument	Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software	Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software	BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD, France
Plate shaker	Corning, USA
TECAN Microplate Washer	Tecan, Switzerland	HydroSpeed
Vortex Genie 2	Scientific Industries inc, USA	G560E
Pipettes	Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube	Axygen, USA	MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip	Eye Care and Cure, USA	101657
Flexmap 3D Calibration Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-028
Flexmap 3D Verfication Kit	Luminex Corp, Austin, TX, USA	40-029
Ocular examination chair