Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse
Summary
Die präzise Lokalisierung der Golgi-Bewohner ist wesentlich für das Verständnis der zellulären Funktionen der Golgi. Konventionelle Lichtmikroskopie ist jedoch nicht in der Lage, die Sub-Golgi-Struktur zu lösen. Hier beschreiben wir das Protokoll für eine konventionellen Mikroskopie basierte Höchstauflösung Methode, um die Sub-Golgi Lokalisation eines Proteins quantitativ zu bestimmen.
Abstract
Der Golgi-Komplex besteht aus seriell gestapelten Membran Cisternen, die in Sub-Golgi Regionen, einschließlich der GUS-Staatenweiter kategorisiert werden können-Golgi, Medial-Golgi, Trans-Golgi und Trans-Golgi-Netzwerk. Zellfunktionen der Golgi werden durch die charakteristische Verteilung der ansässigen Proteine bestimmt. Die räumliche Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie ist zu niedrig um Sub-Golgi Struktur oder Cisternen zu lösen. So ist Immuno-Gold-Elektronen-Mikroskopie eine Methode der Wahl, ein Protein auf der Sub-Golgi-Ebene zu lokalisieren. Das Instrument und Technik sind jedoch darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Hier beschreiben wir unsere neu entwickelte Höchstauflösung Methode namens Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi-Protein zu lokalisieren. GLIM basiert auf standard Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle und konventionellen Weitfeld- oder konfokale Mikroskope. Es geht um die Kalibrierung der chromatischen Verschiebung Aberration des mikroskopischen Systems, die Bildaufnahme und die Analyse nach der Übernahme. Die Sub-Golgi Lokalisierung eines Test-Proteins wird quantitativ die Lokalisierung Quotienten ausgedrückt. Es gibt vier Hauptvorteile von GLIM; Es ist schnell, bezogen auf konventionelle Methoden und Werkzeuge, das Ergebnis der Lokalisierung ist quantitativ und es bietet ~ 30 nm praktische Auflösung entlang der Golgi-Achse. Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll der GLIM einenTest Golgi Protein zu lokalisieren.
Introduction
Der Golgi-Komplex spielt entscheidende Rolle sekretorischen/endocytic Handel von Proteinen und Lipiden (im folgenden Ladungen) in Säugerzellen1,2,3. Bei der Golgi sind Ladungen nicht nur auf verschiedenen subzellulären Fächer sortiert sondern auch durch verschiedene Arten der Glykosylierung modifiziert. Der Säugetier-Golgi-Komplex umfasst zahlreiche seitlich angeschlossene Golgi-Stapel, die besteht in der Regel von 4-11 eng benachbarte und flache Membran Säcken genannt Cisternen. Seriell gestapelten Golgi-Cisternen werden weiter kategorisiert, von einem Ende zum anderen, als GUS, Medial und Trans-Cisternen. Auf der Trans-Seite aus einem Golgi-Stapel, der Trans-die meisten Membran Sac entwickelt sich zu einem röhrenförmigen und Retikulum Membran-Netzwerk namens Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)4. In der sekretorischen Weg Ladungen abgeleitet aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) geben Sie einen Golgi-Stapel in die GUS-Seite und dann nacheinander durchlaufen die Medial und Trans-Cisternen. Ladungen beenden schließlich die Golgi auf dem Trans-Golgi oder TGN destining der Plasmamembran, Endosomen oder sekretorischen Granulat.
Die molekularen und zellulären Mechanismen der wie Ladungen einen Golgi-Stapel transit und wie die Golgi seine cisternal Organisation unterhält bleibt mysteriös und werden derzeit noch eine hitzige Debatte1. Schwierigkeiten in diesem Bereich gehört, dass Golgi-Cisternen nur unter der Elektronenmikroskopie (EM) seit dem Beschluss von einem optischen Mikroskop gelöst werden können (~ 200 nm) nicht ausreicht, einzelne Golgi-Cisternen (< 100 nm in beiden cisternal Dicke zu lösen (und Entfernung). Daher werden die Sub-Golgi Lokalisierung von ansässigen Proteine und Transit Ladungen konventionell von Immuno-Gold EM bestimmt. Jedoch die Immuno-Gold-EM ist technisch sehr anspruchsvoll und es ist darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Obwohl die Auflösung der EM kann Sub-Nanometer, die Auflösung durch die Immuno-Gold EM gewährte wird stark von der Größe des Antikörpers Komplex (PV plus der Sekundärantikörper) und das gold Partikel behindert, und es schlimmer, als 20 sein kann nm. Darüber hinaus stammen EM Bilder von dünn-2D-Schnitte statt eine globale 3D-Ansicht des Golgi, die abhängig von der relativen Position und Ausrichtung der 2D-Schnitt5falschen Schlüssen führen kann. Beispielsweise kann ein EM einteiligen Studium ein Vesikels zuverlässig aus der orthogonalen Ansicht von einem Röhrchen zu unterscheiden, da beide identische Runde Membran Profile angezeigt werden können. Die letzten Advent Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken, wie 3D-strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (3D-SIM), stimulierte Emission Depletion (STED), photoaktiviert-Lokalisierung-Mikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie ( (Sturm), ermöglicht es, Sub-Golgi Strukturen im Rahmen von Lichtmikroskopen6zu beheben. Allerdings gibt es mindestens vier Nachteile, die ihre Verwendung in der Zelle biologische Studie von der Golgi erheblich einschränken können. (1) aktuelle Höchstauflösung Techniken erfordern teure und spezielle Hardwarekonfiguration ist darüber hinaus die meisten Zelle Biologie Labors. (2) spezielle Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle sind für einige super-Resolution-Techniken erforderlich. (3) Obwohl diese Techniken unter dem besten Zustand, 20-110 nm in räumlicher Auflösung beanspruchen, kann die praktische Auflösung in realen Proben erhalten viel schlimmer sein. (4) im Vergleich zu konventionellen Mikroskopie diese super-Resolution-Techniken noch haben Schwierigkeiten bei der Durchführung von mehrfarbigen, 3D oder live Cell imaging, entweder einzeln oder in Kombination. Wahrscheinlich führen vor allem Immuno-Gold-EM und die Höchstauflösung Mikroskopiertechniken qualitative statt quantitative Lokalisierungsdaten.
Versuch, teilweise oben genannten Probleme zu lösen, haben wir vor kurzem eine konventionelle Lichtmikroskopie basierte Methode entwickelt benannt Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi lokalisieren Protein mit einer Auflösung entspricht dem von der Immuno-Gold EM-7. Bei dieser Methode ist die Golgi in kultivierten Säugerzellen als Golgi Mini-Stapel durch die Behandlung von Nocodazole, ein depolymerizing Medikament Mikrotubuli verstreut. Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass Nocodazole-induzierten Golgi Mini-Stacks (im folgenden Golgi Mini-Stacks) native Golgi-Stapel in Organisation und Zellfunktionen8,9,10ähneln, 11. Die Lokalisierung Quotient (LQ) eines Test-Proteins durch GLIM erworben werden kann und es bezeichnet die quantitative Sub-Golgi-Lokalisierung. Die Zahlenwerte der LQs verglichen werden können und eine LQ-Datenbank mit mehr als 25 Golgi Marker zur Verfügung gestanden hat.
Golgi Mini-Stacks sind in GLIM dreifach-Label von endogen oder exogen ausgedrückt GM130, GalT mCherry und Test-Protein (X). GM130 und GalT-mCherry, Cis– und Trans-Golgi-Marker bzw.12,13, bieten Bezugspunkte. Die dreifache Fluoreszenz, rot (R), grün (G) und dunkelrote (B), künstlich als rot, grün und blau, beziehungsweise angezeigt. Zentrum der Fluoreszenz Masse (im folgenden Mitte) wird angenommen, um Sub-Pixel-Auflösung zu erreichen. Die Golgi-Achse ist definiert als der Vektor aus der Mitte des GM130 mit der GalT-mCherry. Die Golgi-Mini-Stack wird als eine zylindrische Struktur mit unendlichen Rotationssymmetrie um die Golgi-Achse modelliert. Daher kann ein Mini-Golgi-Stapel weiter als eine eindimensionale Struktur entlang der Golgi-Achse modelliert werden. Die LQ Test Protein X ist definiert als dX/d1, in denen dX der Abstand von der Mitte von x mit der GM130, ist während d1 die Entfernung vom Zentrum GalT-mCherry mit der GM130 ist. Wenn x einfallenden liegt, wird seine Projektion axialen Abstand für die Berechnung verwendet. Die Variablen, einschließlich Golgi Achse, axiale Winkel, dX, d1, Winkel α und Winkel β für GLIM sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. LQ ist unabhängig vom axialen Golgi Golgi Mini-Stacks nach dem Zufallsprinzip in eine Zelle zu orientieren.
Golgi Mini-Stacks erscheinen inhomogen in Bildern. Wir entwickelten drei Kriterien um analysierbar Golgi Mini-Stacks für GLIM auszuwählen. (1) das Signal-Rausch-Verhältnis-Kriterium, in dem das Verhältnis von die Gesamtintensität eines Golgi Mini-Stack auf die Standardabweichung (SD) des Hintergrundes ≥ 30 in jedem Kanal ist. Dieses Kriterium ist die Positioniergenauigkeit von der Mitte der Masse, die abhängig von der Signal-Rausch-Verhältnis von Golgi-Mini-Stacks. (2) die axiale Winkel oder Abstand Kriterium, wonach d1≥ 70 nm. d1 nimmt mit der Erhöhung des Golgi axiale Winkels. Wenn die axiale Winkel nähert sich 90° oder senkrecht, die Mini-Stack wird als d1 nicht auflösbar nähert sich 0. d1≥ 70 nm kann wirksam ausschließen, in der Nähe von vertikalen Golgi Mini-Stacks. (3) die co-Linearität Kriterium, in dem entweder | tan α | oder | tan β | ≤ 0,3 ist. Dieses Kriterium wird sichergestellt, dass die drei Zentren eines Mini-Stack ausreichend für unser eindimensionales Modell des Golgi Mini-Stack linear sind. Alle Lichtmikroskopen leiden chromatische Aberration, die ernsthaft die relativen Positionen der rot-, grün- und dunkelrote Fluoreszenz Zentren verzerren können. Chromatische Aberration von Mikroskopsystemen wird experimentell durch bildgebende 110 nm-Perlen, die Dreifach-gekennzeichnet durch rote, grüne und dunkelrote Fluoreszenz sind kalibriert. Für jedes Bild Perle die Mitte des roten ist definiert als die tatsächliche Position des Wulstes und chromatische Veränderungen der grünen und dunkelrote Zentren sind von erster Ordnung Polynomfunktionen ausgestattet. Zentren der Golgi Mini-Stacks unterliegen der Polynomfunktionen, die chromatische Veränderungen in grün und dunkelrote Kanäle zu korrigieren.
Durch GLIM erreichen wir eine Auflösung von ~ 30 nm entlang der Golgi-Achse unter Standardbedingungen. Wichtiger ist, bietet es eine systematische Methode um alle Golgi-Protein quantitativ abzubilden. GLIM kann durch konventionelle Mikroskope, wie z. B. Weitfeld- oder konfokale Mikroskope mit gemeinsamen Fluoreszenz Kennzeichnung Protokollen durchgeführt werden. Die Bildgebung und Datenverarbeitung können so kurz wie eine Stunde dauern. Durch GLIM, haben wir direkt bewiesen die progressiven Übergang der sekretorischen Ladung aus der Cis– Trans-Seite des Golgi-7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Lokalisation eines Proteins Golgi unter der Lichtmikroskopie war bisher vor allem durch den Grad der Korrelation oder Überlappung des Bildes des Proteins mit dem Bild einer Golgi-Markierung von bekannten Lokalisierung15,16quantifiziert, 17. Resultierende Korrelation oder überlappende Koeffizient spiegelt wider, wie nah das Test-Protein die Golgi-Marker räumlich ist. Es gibt mindestens drei Einschränkungen für diesen An…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Vereinigtes Königreich) für die TPST1-EGFP DNA Plasmid, Lakshmi Narasimhan Govindarajan Danke für die Hilfe bei der Software-Optimierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerium für Bildung (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 und RG132/15 und AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073), l.l.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
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