לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה
Summary
ההתאמה המדויקת של תושבים גולג’י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג’י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג’י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג’י של חלבון.
Abstract
הקומפלקס גולג’י מורכב cisternae ממברנה מוערמים באופן סדרתי אשר יכולים להיות מסווגים נוספים לתוך אזורים תת-גולג’י, כולל את חבר העמים-המדיאלי-גולג’י, גולג’י, טרנס-גולג’י ושומן טראנס-רשת גולג’י. פונקציות הסלולר של גולג’י נקבעים לפי ההתפלגות האופיינית מהחלבונים תושב. הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי הוא נמוך מדי כדי לפתור sub-גולג’י מבנה או cisternae. לפיכך, מיקרוסקופ אלקטרונים חיסונית-זהב היא שיטה של בחירה כדי להתאים לשפה חלבון ברמה תת-גולג’י. עם זאת, הטכניקה ואת כלי הנגינה הם מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. נתאר כאן שיטת רזולוציה סופר שפותחו לאחרונה שלנו נקרא גולג’י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM) למקם באופן שיטתי, באופן כמותי חלבון גולג’י. GLIM מבוסס על קרינה פלואורסצנטית רגילה פרוטוקולים תיוג ו רחב-שדות קונבנציונלי או מיקרוסקופ קונפוקלי. זה כרוך הכיול של אברציה כרומטית-shift של המערכת מיקרוסקופיים, רכישת התמונה הניתוח שלאחר הרכישה. לוקליזציה תת-גולג’י של חלבון מבחן מבוטאת באופן כמותי המנה לוקליזציה. ישנם ארבע היתרונות העיקריים של GLIM; זה מהיר, המבוסס על שיטות קונבנציונליות וכלים, התוצאה לוקליזציה היא כמותית, היא מעניקה ~ 30 ננומטר רזולוציה מעשית לאורך הציר גולג’י. כאן נתאר את פרוטוקול מפורט של GLIM כדי להתאים לשפה בדיקת חלבון גולג’י.
Introduction
המתחם גולג’י ממלא תפקידים חיוניים ב סחר הפרשה/endocytic של חלבונים ושומנים (להלן וחקלאיים) תאים בתרבית של1,2,3. -גולג’י, ושינוע מטענים הם לא רק ממוין to תאים סלולריים תת השונים אלא גם שונה על-ידי סוגים מגוונים של גליקוזילציה. המתחם גולג’י יונקים כוללת רבים ערימות גולג’י מחוברים רוחבית, אשר מורכב בדרך כלל 4-11 ממברנה בחוזקה סמוכים ושטוחים שקי שנקרא cisternae. Cisternae גולג’י באופן סדרתי מוערמים מסווגים, מקצה אחד לשני, כמו חבר העמים, המדיאלי, טרנס-cisternae. – טרנס-הצד של ערימה גולג’י, טרנס-שק ממברנה רוב מתפתח מרשת ממברנה צינורי, רשת הנקראת טרנס-גולג’י רשת (TGN)4. השביל הפרשה וחקלאיים נגזר תוך-פלזמית (ER) הזן ערימה גולג’י-שלה cis-בצד ולאחר מכן ברצף להעביר דרך המדיאלי, טרנס-cisternae. וחקלאיים לצאת בסופו של דבר את גולג’י- טרנס-גולג’י או TGN destining קרום פלזמה, endosomes או בגרגרים הפרשה.
המנגנונים הסלולר המולקולריים של איך וחקלאיים מעבר ערימה גולג’י ושומר על איך גולג’י האירגון cisternal להישאר מסתורי והן נמצאות כרגע עדיין תחת דיונים1. אחד הקשיים בתחום זה היא כי cisternae גולג’י בלבד ניתן לפתור תחת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאז הרזולוציה של מיקרוסקופ אופטי (~ 200 ננומטר) אינה מספיקה לפתור גולג’י בודדים cisternae (< 100 ננומטר בעובי שני cisternal והמרחק). לכן, לוקליזציה תת-גולג'י של חלבונים תושב, הם מגיעים וחקלאיים כמקובל נקבעות לעוב חיסונית-זהב. עם זאת, לעוב חיסונית-זהב הוא תובעני מאוד טכנית, זה מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. למרות הרזולוציה של האלקטרומגנטיות יכול להיות תת ננומטר, הרזולוציה המוענקת על ידי לעוב חיסונית-זהב היא במידה רבה הקשו על ידי הגודל של הנוגדן מורכב (יסודי בתוספת הנוגדן המשני) לבין החלקיק זהב, זה יכול להיות גרוע יותר 20 ננומטר. יתר על כן, תמונות EM מתקבלים ממקטעים 2D דק-במקום תצוגה גלובלית תלת-ממד של גולג'י, אשר עלולה לגרום מסקנות שגויות בהתאם המיקום היחסי ואת כיוון ההדפסה של 2D סעיף5. לדוגמה, ללמוד מקטע יחיד אם אין אפשרות להבחין בצורה אמינה של שלפוחית מהתצוגה אורתוגונלית של צנורית, מאז שניהם ניתן להציג פרופילים זהים ממברנה עגול. הופעתו האחרונה של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה, כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה תלת-ממד (3D-SIM), גירוי דלדול פליטה (STED), מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ ( סופה), מאפשר לפתור מבנים תת-גולג’י תחת מיקרוסקופ אור6. עם זאת, ישנם חסרונות לפחות ארבעה זה יכול להגביל באופן משמעותי את השימושים שלהם בחקר התא הביולוגי גולג’י. 1) רזולוציה סופר הנוכחי טכניקות דורש הגדרת תצורה של חומרה יקר ומיוחד אשר אינה רוב מעבדות ביולוגיה של התא. 2) פרוטוקולים תיוג זריחה מיוחד יש צורך כמה טכניקות סופר רזולוציה. 3) למרות, בתנאים הטובים ביותר, טכניקות אלו טוענים nm 20-110, רזולוציה מרחבית, הרזולוציה המעשי שהושג בדגימות אמיתי יכול להיות הרבה יותר גרוע. 4) בהשוואה מיקרוסקופ רגיל, טכניקות אלו סופר-רזולוציה עדיין יש קשיים בביצוע ססגוניות, תלת-ממד או לחיות תא הדמיה, ביחידים או בשילוב. כנראה והכי חשוב, חיסונית-זהב EM והן את הטכניקות מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה תשואות איכותי במקום נתונים כמותיים לוקליזציה.
ניסיון חלקית לפתור את הבעיות שהוזכרו לעיל, לאחרונה פיתחנו שיטה המקובלת מיקרוסקופ אור מבוסס, אשר הוזכר גולג’י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM), למקם באופן שיטתי, באופן כמותי גולג’י חלבונים ברזולוציה מקבילה לזו של EM חיסונית-זהב7. בשיטה זו, גולג’י בתרבית תאים בתרבית של מפוזרת כמו מיני גולג’י-במחסן על ידי הטיפול של nocodazole, תרופה depolymerizing microtubule. מחקרים מקיפים הוכיחו כי nocodazole-induced גולג’י מיני-במחסן (להלן גולג’י מיני-ערימות) הדומים יליד ערימות גולג’י הארגון והן תאיים8,9,10, 11. ניתן לרכוש את המנה לוקליזציה (LQ) של חלבון מבחן דרך GLIM, זה מרמז על לוקליזציה תת כמותית-גולג’י. ניתן להשוות את הערכים המספריים של LQs, קיו מסד נתונים של יותר מ-25 גולג’י סמני הייתה זמינה.
ב GLIM, גולג’י מיני-במחסן הם עם התווית משולשת על ידי אנדוגני או ביטוי exogenously GM130, גולט-mCherry החלבון מבחן (x). GM130 וגולט-mCherry, cis– וטרנס-סמני גולג’י בהתאמה12,13, לספק נקודות התייחסות. טריפל פלורסצנטיות, אדום (R), ירוק (G) ומרחיקת אדום (B), באופן מלאכותי מוצגים כמו אדום, ירוק וכחול, בהתאמה. מרכז מסה קרינה פלואורסצנטית (להלן-המרכז) הוא מאומץ כדי להשיג תת פיקסל ברזולוציה. הציר גולג’י מוגדר וקטור ממרכז של GM130 לזה של גולט-mCherry. הערימה מיני גולג’י הוא המודל כמבנה גלילי עם אינסוף סימטריה סיבובית סביב הציר גולג’י. לכן, ערימה מיני גולג’י שניתן למדל נוספות כמו מבנה חד-ממדי לאורך הציר גולג’י. מנת משכל של החלבון במבחן x מוגדרת בתור dx/d1, שבו dx הוא המרחק מן המרכז של x לזו של GM130, בעוד d1 הוא המרחק מן המרכז גולט-mCherry של GM130. אם המרכז של x מהציר, מרחק צירית שלה הקרנה משמש לחישוב. המשתנים, כולל גולג’י ציר, זווית צירית, dx, d1, הזווית α β זווית, עבור GLIM מומחשים סכמטי באיור1. LQ היא עצמאית של הזווית צירית גולג’י למרות גולג’י מיני-במחסן אוריינט באקראי בתא.
גולג’י מיני-במחסן מופיעים inhomogeneous בתמונות. פיתחנו שלושת הקריטריונים לבחירת בקופסאת גולג’י מיני-ערימות עבור GLIM. 1. קריטריון) יחס אות לרעש, שבו היחס בין עוצמת ערימה מיני גולג’י כדי סטיית התקן (SD) של הרקע הכולל הוא ≥ 30 בכל ערוץ. קריטריון זה נועד להבטיח דיוק מיקום מרכז מסה, אשר תלויה יחס אות לרעש של מיני גולג’י-במחסן. 2) מפוח הזווית או המרחק הקריטריון, המחייב d1≥ 70 ננומטר. d1 יורדת עם העלייה של הזווית צירית גולג’י. כאשר הזווית צירית מתקרב 90° או אנכי, הערימה המצומצמת תהיה בלתי-ניתן לפתור כמו d1 מתקרב 0. d1≥ 70 nm יכול לכלול ביעילות ליד מיני גולג’י אנכי-במחסן…. 3 קריטריון) co-ליניאריות, שבו גם | שיזוף α | או | שיזוף β | הוא ≤ 0.3. קריטריון זה מבטיח שלושת המרכזים ערימה מיני יהיו מספיק co-ליניארי עבור שלנו מודל חד-ממדי של הערימה מיני גולג’י. מיקרוסקופ אור כל סובלים אברציה כרומטית אשר ברצינות יכולה לעוות את המיקומים היחסיים של מרכזי פלורסצנטיות מרחיקת אדום, ירוק ואדום. אברציה כרומטית של מיקרוסקופ מערכות השפעול מכויל על ידי הדמיה 110 חרוזים ננומטר, אשר עם התווית שלוש פעמים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום, ירוק ואדום. עבור כל תמונה חרוז, מרכז אדום מוגדר מיקומו האמיתי של החרוז, כרומטית-משמרות של מרכזי מרחיקת אדום וירוק הם מצויד ידי פונקציות פולינום מסדר ראשון. מוקדי גולג’י מיני-במחסן הם נתון את פונקציות פולינום לתקן כרומטית-במאזן ערוצי מרחיקת אדום וירוק.
באמצעות GLIM ניתן להשיג רזולוציה של ~ 30 ננומטר לאורך הציר גולג’י בתנאים רגילים. חשוב, זה מספק שיטה שיטתית למפות באופן כמותי את כל חלבון גולג’י. GLIM יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון שדה רחב או מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות פרוטוקולים תיוג נפוצות של זריחה. הדמיה ועיבוד נתונים יכול לקחת קצר ככל שעה. דרך GLIM, ישירות הראו את המעבר פרוגרסיבי של המטען הפרשה מחבר ציס– טרנס-הצד של גולג’י7.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, הלוקליזציה של חלבון גולג’י תחת מיקרוסקופ אור הייתה לכמת בעיקר על ידי מידת המתאם או חופפים של התמונה של החלבון עם התמונה של סימן גולג’י לוקליזציה ידוע15,16, 17. המתאם המתקבל או מקדם חופפים משקף כמה קרוב החלבון הבדיקה היא דה מרקר גולג’י במ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ד סטיבנס (אוניברסיטת בריסטול, בריסטול, אנגליה) על פלסמיד דנ א TPST1-EGFP, וכן Narasimhan Govindarajan לאקשמי שעזרת עם תוכנת אופטימיזציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן נבחרת המועצה למחקר רפואי (NMRC/CBRG/007/2012), משרד החינוך (RG Tier1 AcRF 18/11, RG 48/13 ו- RG132/15 ו- AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) שראשי
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
