Quantitativa localizzazione di una proteina di Golgi da Imaging sua massa centro di fluorescenza
Summary
La precisa localizzazione dei residenti di Golgi è essenziale per la comprensione delle funzioni cellulari di Golgi. Tuttavia, la microscopia ottica convenzionale non riesce a risolvere la struttura sub-Golgi. Qui descriviamo il protocollo per un metodo di Super-risoluzione di microscopia convenzionale basato determinare quantitativamente la localizzazione sub-Golgi di una proteina.
Abstract
Il complesso di Golgi è costituito da cisterne di membrana impilate in serie che possono essere ulteriormente classificate in regioni sub-Golgi, tra cui il cis-Golgi, mediale-Golgi, trans-Golgi e trans-Golgi network. Funzioni cellulari di Golgi sono determinate tramite la distribuzione caratteristica delle sue proteine residenti. La risoluzione spaziale di microscopia chiara convenzionale è troppo bassa per risolvere la struttura sub-Golgi o cisterne. Così, la microscopia elettronica di immuno-oro è un metodo di scelta per la localizzazione di una proteina a livello sub-Golgi. Tuttavia, la tecnica e lo strumento sono oltre la capacità della maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. Descriviamo qui il nostro metodo sviluppato di recente super-risoluzione chiamato la localizzazione della proteina di Golgi da imaging centri di massa (GLIM) sistematicamente e quantitativamente localizzare una proteina di Golgi. GLIM è basato su protocolli d’etichettatura fluorescenza standard e grandangolari convenzionali o microscopi confocali. Coinvolge la calibrazione di aberrazione cromatica-spostamento del sistema al microscopio, l’acquisizione dell’immagine e l’analisi post-acquisizione. La localizzazione sub-Golgi di una proteina di prova è espressa quantitativamente come il quoziente di localizzazione. Ci sono quattro principali vantaggi del GLIM; è rapido, basato su strumenti e metodi convenzionali, il risultato di localizzazione è quantitativo e offre ~ 30 risoluzione pratica nm lungo l’asse di Golgi. Qui descriviamo il protocollo dettagliato di GLIM per localizzare un test della proteina di Golgi.
Introduction
Il complesso di Golgi gioca ruoli essenziali secretiva/endocitico traffico di proteine e lipidi (d’ora in poi carichi) in cellule di mammifero1,2,3. Al Golgi, carichi sono non solo ordinati ai vari compartimenti sub-cellulari ma anche modificati da diversi tipi di glicosilazione. Il complesso di Golgi dei mammiferi comprende numerosi lateralmente collegate pile di Golgi, che in genere consiste di 4-11 sacs di membrana strettamente adiacenti e piatto chiamato cisterne. Delle cisterne di Golgi in serie in pila vengono ulteriormente classificate, da un’estremità a altra, come CSI, mediale e trans-cisterne. Presso il trans-lato di uno stack di Golgi, la trans-sac membrana la maggior parte si sviluppa in una rete di membrana tubolare e reticolo chiamata trans-Golgi network (TGN)4. Nella via secretiva, carichi derivati dal reticolo endoplasmatico (ER) inserire una pila di Golgi al suo cis-lato e poi in sequenza passano attraverso mediale e trans-cisterne. Carichi alla fine uscire il Golgi presso il trans-Golgi o TGN destinava alla membrana plasmatica, endosomi o granuli secretori.
I meccanismi molecolari e cellulari di come carichi transitano una pila di Golgi e come il Golgi mantiene la sua organizzazione citernale rimangono misteriosi e sono attualmente ancora in un acceso dibattito1. Una delle difficoltà in questo campo è che cisterne di Golgi possono essere risolto solo sotto la microscopia elettronica (EM) dopo la risoluzione di un microscopio ottico (~ 200 nm) è insufficiente a risolvere singoli cisterne di Golgi (< 100 nm in entrambi citernale spessore e distanza). Pertanto, la localizzazione sub-Golgi proteine residenti e carichi in transito sono convenzionalmente determinato dal EM di immuno-oro. Tuttavia, il EM di immuno-oro è tecnicamente molto impegnativo ed è oltre la capacità della maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. Anche se la risoluzione di EM può essere sub-nanometrica, la risoluzione offerta dal EM di immuno-oro è notevolmente ostacolata dalle dimensioni dell'anticorpo complesso (primaria più l'anticorpo secondario) e la particella d'oro e può essere peggio di 20 nm. Inoltre, immagini di EM sono ottenuti da sottili sezioni 2D anziché una vista 3D globale di Golgi, che può portare a conclusioni errate a seconda della posizione relativa e l'orientamento della sezione 2D5. Ad esempio, studiando un singolo-sezione EM è in grado di differenziare in modo affidabile una vescicola dalla visualizzazione ortogonale di un tubulo poiché entrambi in grado di visualizzare profili identici della membrana rotonda. Il recente avvento di tecniche di microscopia di Super-risoluzione, come microscopia di illuminazione strutturato 3D (3D-SIM), stimolato svuotamento dell’emissione (STED), microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM) e stocastico ricostruzione ottica microscopia ( TEMPESTA), permette di risolvere strutture sub-Golgi sotto microscopi ottici6. Tuttavia, ci sono almeno quattro inconvenienti che possono limitare significativamente il loro impiego nello studio biologico delle cellule di Golgi. 1) le attuali tecniche di Super-risoluzione richiedono la configurazione di hardware costoso e speciale che è di là maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. 2) protocolli d’etichettatura fluorescenza speciali sono necessari per alcune tecniche di Super-risoluzione. 3) anche se, sotto la condizione migliore, queste tecniche sostengono 20-110 nm in risoluzione spaziale, la risoluzione pratica ottenuta in campioni reali può essere molto peggio. 4) In confronto a microscopia convenzionale, queste tecniche di Super-risoluzione ancora hanno difficoltà nel condurre multicolor, 3D o live cell imaging, singolarmente o in combinazione. Probabilmente la cosa più importante, sia EM immuno-oro e le tecniche di microscopia di Super-risoluzione resa qualitativa anziché dati di localizzazione quantitativa.
Tentando di risolvere parzialmente i problemi di cui sopra, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di microscopia chiara convenzionale basato, che è denominato la localizzazione della proteina di Golgi da imaging centri di massa (GLIM), sistematicamente e quantitativamente localizzare un Golgi proteina a una risoluzione equivalente a quella della immuno-oro EM7. In questo metodo, il Golgi in cellule di mammiferi coltivate è disperso come mini-stack di Golgi dal trattamento di nocodazole, una droga depolimerizzanti dei microtubuli. Studi approfonditi hanno dimostrato che indotta da nocodazole Golgi mini-stack (in seguito Golgi mini-stack) sono molto simili gli stack in organizzazione e funzioni cellulari8,9,10, nativi di Golgi 11. Il quoziente di localizzazione (LQ) di una proteina di prova possa essere acquistato attraverso GLIM e denota la localizzazione sub-Golgi quantitativa. I valori numerici di LQs può essere confrontati e un database LQ di più di 25 indicatori di Golgi è stato disponibile.
In GLIM, Golgi mini-stack sono triple-etichettati da endogeno o esogenicamente espresso GM130, GalT-mCherry e la proteina di test (x). GM130 e GalT-mCherry, cis– e trans-Golgi marcatori rispettivamente12,13, fornire punti di riferimento. La fluorescenza Tripla, rossa (R), verde (G) e da’ (B), artificialmente vengono visualizzati come rosso, verde e blu, rispettivamente. Centro di massa di fluorescenza (in seguito centro) è adottato per realizzare sub-pixel di risoluzione. L’asse di Golgi è definito come il vettore dal centro di GM130 a quella di GalT-mCherry. Lo mini-stack di Golgi è modellato come una struttura cilindrica con infinito simmetria di rotazione attorno all’asse di Golgi. Di conseguenza, una mini-pila Golgi possa essere ulteriormente modellata come una struttura unidimensionale lungo l’asse di Golgi. Il LQ della proteina della prova x è definito come dx/d1, in cui dx è la distanza dal centro della x a quella di GM130, mentre d1 è la distanza dal centro di GalT-mCherry a quella di GM130. Se il centro di x è fuori asse, la sua distanza di proiezione assiale è utilizzato per il calcolo. Le variabili, tra cui Golgi asse, angolo assiale, dx, d1, angolo α e β angolo, per GLIM sono schematicamente illustrate nella Figura 1. LQ è indipendente dell’angolo assiale Golgi anche se mini-stack di Golgi orientare in modo casuale in una cella.
Golgi mini-stack appaiono disomogeneo nelle immagini. Abbiamo sviluppato tre criteri per selezionare analyzable Golgi mini-stack per GLIM. 1) il criterio del rapporto segnale-rumore, in cui il rapporto tra l’intensità totale di una mini-pila Golgi per la deviazione standard (SD) dello sfondo è ≥ 30 in ciascun canale. Questo criterio è quello di garantire la precisione di posizionamento del centro di massa, che dipende i rapporti segnale-rumore di Golgi mini-stack. 2) il criterio di angolo o la distanza assiale, che richiede d1≥ 70 nm. d1 diminuisce all’aumentare dell’angolo assiale Golgi. Quando l’angolo assiale si avvicina a 90° o verticale, mini-stack diventa non-risolvibile come d1 si avvicina a 0. d1≥ 70 nm può escludere efficacemente vicino verticale Golgi mini-stack. 3) il criterio della co-linearità, in cui uno | tan α | o | tan β | è ≤ 0,3. Questo criterio assicura che i tre centri di un mini-stack sono sufficientemente co-lineare per il nostro modello unidimensionale della mini-pila Golgi. Tutti i microscopi ottici soffrono di aberrazione cromatica che può distorcere seriamente le posizioni relative dei centri di rosso, verde e da’ fluorescenza. Aberrazione cromatica di sistemi di microscopia è calibrato sperimentalmente da imaging 110 perline di nm, che sono triple-etichettati da fluorescenza rosso, verde e da’. Per ogni immagine della perla, il centro di rosso è definito come la vera posizione del tallone e cromatico-turni di verdi e da’ centri dispongono di funzioni polinomiali di primo ordine. Centri di Golgi mini-stack sono sottoposti alle funzioni polinomiali per correggere il cromatica-turni nei canali verde e da’.
Attraverso GLIM possiamo ottenere una risoluzione di ~ 30 nm lungo l’asse di Golgi in condizioni standard. Cosa importante, fornisce un metodo sistematico per mappare quantitativamente qualsiasi proteina di Golgi. GLIM può essere eseguita da microscopi convenzionali, quali grandangolari o microscopi confocali, utilizzando comuni protocolli d’etichettatura di fluorescenza. La formazione immagine e elaborazione dati può prendere più breve come un’ora. Attraverso GLIM, abbiamo direttamente dimostrato la progressiva transizione del carico secretiva da cis– Trans-lato del Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
In precedenza, la localizzazione di una proteina di Golgi sotto microscopia chiara pricipalmente è stata quantificata dal grado di correlazione o la sovrapposizione dell’immagine della proteina con l’immagine di un marcatore di Golgi di localizzazione noto15,16, 17. La correlazione risultante o sovrapposti coefficiente riflette quanto vicino la proteina test è il marker di Golgi spazialmente. Ci sono almeno tre avvertimenti p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare D. Stephens (Università di Bristol, Bristol, Regno Unito) per il plasmide del DNA TPST1-EGFP, così come Lakshmi Narasimhan Govindarajan per aiutare con l’ottimizzazione del software. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dal National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministero dell’istruzione (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 e 15/RG132 e AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) di L.L.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
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