そのセンターの蛍光質量イメージングによるゴルジ体タンパク質の量的なローカリゼーション
Summary
ゴルジの住民の正確な局在はゴルジ体の細胞の機能を理解するために不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡ではサブ ゴルジ構造を解決できません。ここで定量的蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在を決定する従来の顕微鏡による超解像法のプロトコルについて述べる。
Abstract
ゴルジ複合体から成っているcisを含むサブ ゴルジ領域にさらに分類できる直列積層膜 cisternae-ゴルジ、内側-ゴルジ体トランス-ゴルジとトランス-ゴルジ ネットワーク。細胞ゴルジ装置の機能は、その居住者のタンパク質の分布特性によって決定されます。従来の光学顕微鏡の空間分解能が小さすぎるため、サブ ゴルジ構造または cisternae 解決。したがって、免疫金電子顕微鏡はサブ ゴルジ体レベルでタンパク質をローカライズする選択の方法です。しかし、技術と楽器はほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えるです。ここで質量の中心 (かすかな光) 体系的かつ定量的ローカライズ ゴルジ体のタンパク質のイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションと呼ばれる最近開発された超解像手法について述べる。かすかな光は、共焦点顕微鏡や従来の広視野標準蛍光ラベリング プロトコルに基づいています。それは顕微鏡システム、画像の取得と取得後解析波長シフト収差の校正を含みます。テスト蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在は定量的局在商として表されます。かすかな光の 4 つの主な利点があります。それは急速に従来の方法とツールに基づいて、ローカライズ結果は定量的、それを与える 〜 ゴルジ体軸に沿って 30 nm 実用的な解像度。ここでテストのゴルジ体のタンパク質をローカライズするかすかな光の詳しいプロトコルについて述べる。
Introduction
ゴルジ複合体は、哺乳類細胞1,2,3でタンパク質や脂質 (以下貨物) の分泌/エンドサイトーシス人身売買に必須の役割を果たしています。ゴルジ体、貨物だけでなく様々 な細胞内コンパートメントにソートしますが、グリコシル化反応の様々 な種類によっても変更します。哺乳類のゴルジ複合体は、通常から成っている 4-11 しっかりと隣接してフラット膜嚢 cisternae と呼ばれる多数の横に接続されているゴルジ スタックを構成されています。順次積み上げゴルジさらとして分類される、他の一方の端からcis内側、トランス-cisternae。トランスで-側ゴルジ スタック、トランス–トランスと呼ばれる管状、胞体膜ネットワークに発展するほとんどの膜嚢-ゴルジ ネットワーク (TGN)4。分泌経路の小胞体 (ER) から派生した貨物は、そのcisでゴルジ スタックを入力-側し、順次内側とトランスを通過-cisternae。貨物が最終的にトランスでゴルジを終了-ゴルジ体や TGN 膜、エンドソームまたは分泌顆粒に運命にあります。
貨物がゴルジ スタックを通過する方法とゴルジ装置がその大槽内の組織を維持する方法の分子・細胞メカニズムは謎のままし、激論1の下でまだ現在が。このフィールドの難しさの 1 つはゴルジのみ解決できることを電子顕微鏡検査 (EM) の下で光学顕微鏡の解像度から (~ 200 nm) 個々 のゴルジ (< 100 nm 両方の大槽内厚を解決するのに十分ではないです。距離)。したがって、居住者のタンパク質とトランジット貨物のサブ ゴルジ装置の局在は、従来免疫金 EM によって決まります。しかし、免疫金 EM は技術的に非常に難しく、それはほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えています。EM の解像度は、サブナノメータをすることができます、免疫金 EM によって与えられる解像度が大きく複雑な抗体 (一次および二次抗体) のサイズと金粒子によって妨げられて、それは 20 よりも悪化することができますが nm。さらに、EM 画像は相対的な位置と 2D 断面図5の向きによって誤った結論につながるゴルジ装置の 3 D 地球ビューではなく 2D 薄いセクションから取得されます。たとえば、EM の単一セクションの勉強は両方は同一ラウンド膜プロファイルを表示することができますので、確実に、尿細管の直交ビューから、小胞を区別することがないです。排出量の枯渇 (STED)、センサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率光再建顕微鏡 (刺激して 3 D 構造照明顕微鏡を用いて (3 D SIM) などの超解像顕微鏡技術の最近の出現嵐)、光顕微鏡6下サブ ゴルジ構造を解決することが可能になります。ただし、ゴルジ体の細胞生物学的研究の使用を大幅に制限することができます、少なくとも 4 つの欠点があります。1) 現在の超解像技術では、高価で特別なハードウェアの構成ほとんどの細胞生物学の実験室を超えている必要があります。2) 特別な蛍光ラベリング プロトコルは、いくつかの超解像技術に必要です。3) が、最高の条件の下でこれらの技術は 20 110 nm の空間分解能を主張、実際サンプルで得られた実用的な解像度が悪化することができます。4) 従来の顕微鏡で比較してこれらの超解像技術まだまたは問題がある実施で多色、3 D ライブ細胞イメージング、単独または組み合わせで。おそらく最も重要なは、免疫金 EM と超解像顕微鏡技術収量定性的定量的なローカリゼーション データの代わりに。
部分的に上記の問題を解決しようとして、我々 は最近 (かすかな光)、体系的にかつ定量的にゴルジをローカライズする質量の中心をイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションの名前は基づく従来の光学顕微鏡法を開発しました。免疫金 EM7と同等の解像度でタンパク質。この方法では培養された哺乳類細胞におけるゴルジ分散ゴルジ ミニ スタックとしてノコダゾール、微小管重合薬物の治療。広範な研究は、組織で細胞機能8,9,10、ネイティブのゴルジ スタックが近いノコダゾール誘起ゴルジ ミニ スタック (以下ゴルジ ミニ ・ スタック) を示しています。 11。テスト蛋白質のローカリゼーション商 (LQ) は、かすかな光を介して取得することができます、それは量的なサブ-ゴルジ装置の局在を表します。LQs の数値の値を比較することができます、以上 25 のゴルジ体マーカーの LQ データベースが利用されています。
かすかな光、ゴルジ ミニ スタックは、内因性あるいは外因表現商品番号:gm130、ゴールト mCherry テスト蛋白質 (x)、トリプル ラベルします。商品番号:gm130 と GalT-mCherry、 cis– および-ゴルジ マーカーそれぞれ1213,,の参照ポイントを提供します。トリプル蛍光、赤 (R)、緑 (G) と遠 (B) 人工的にそれぞれ赤、緑、青、として表示されます。蛍光質量 (以下、センター) の中心は、サブピクセルの解像度を達成するために採用しています。ゴルジ体の軸は、商品番号:gm130 のセンターからゴルト mCherry へのベクトルとして定義されます。ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸周り無限の回転対称性を有する円筒構造としてモデル化されます。したがって、ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸に沿って一次元構造としてさらにモデル化します。LQ テスト蛋白質の x はx/d1、d1は商品番号:gm130 の距離ゴルト mCherry センターからのxは、商品番号:gm130 の x の中心からの距離として定義されています。X の中心は軸を計算のための投影軸距離が使用されます。かすかな光のゴルジ体軸、軸角度、x、d1角度 α、角度 β を含む変数は、図 1に示す図式。LQ は、ゴルジ ミニ スタックのセルにランダムに向きがゴルジ体軸角の独立しています。
ゴルジ ミニ スタック表示画像で不均一です。かすかな光の解析可能なゴルジ ミニ スタックを選択するための 3 つの条件を開発しました。1) 信号対雑音比の基準、ゴルジ ミニ スタック バック グラウンドの標準偏差 (SD) の合計強度の比率は各チャンネルの ≥ 30。この条件は、ゴルジ ミニ スタックの信号対雑音比に依存する重心の位置決め精度を確保するためです。D1≥ 70 が必要です 2) 軸の角度または距離基準 nm。d1ゴルジ体軸角の増加と共に減少します。軸角が 90 ° に近づいているまたは垂直、ミニのスタックになります d1として解決可能な場合は、0 に近づいています。d1≥ 70 nm を垂直ゴルジ ミニ スタック近く効果的に除外できます。3) 直線性基準、いずれかに | α を日焼け |または | β を日焼け |≤ 0.3 です。この基準により、ミニ スタックの 3 つのセンターが十分に co ゴルジ ミニ スタックの 1 次元モデルの線形。すべて光顕微鏡は赤、緑および遠赤色蛍光中心の相対的な位置を歪めることができる真剣に色収差に苦しみます。顕微鏡システムの色収差を 110 nm のビーズがあり、赤、緑、遠赤色蛍光によるトリプル ラベルであるイメージングによる校正実験します。各ビーズ イメージの一次多項式関数によって緑と遠中心の波長シフトが施され、赤のセンターはビードの真の位置として定義されています。ゴルジ ミニ スタックの中心は、緑と遠のチャンネルの波長シフトを修正する多項式関数にさらされます。
かすかな光の解像度を実現することができます 〜 30 nm ゴルジ体軸の標準的な条件の下で。重要なは、定量的、ゴルジ体のタンパク質をマップする体系的な方法を提供します。かすかな光は、全体のフィールドなど、従来の顕微鏡や共焦点顕微鏡、蛍光ラベリングの共通のプロトコルを使用して実行できます。画像とデータ処理は、最短時間で取ることができます。かすかな光を直接を実証した分泌貨物の進歩的な移行からシス–トランス-ゴルジ7の側。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前は、光学顕微鏡のゴルジ体蛋白質のローカリゼーション主の相関または蛋白質の画像とローカリゼーションの既知15,16、ゴルジ体マーカーの画像の重なりの度合いによって定量化を行った 17。結果の相関関係または重複度係数は、どれだけ近いテスト タンパク質はゴルジ体のマーカーに空間的反映されます。このアプ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はソフトウェアの最適化を助けるため TPST1 EGFP DNA のプラスミッドとしてラクシュミ Narasimhan Govindarajan D. ステファン (ブリストルの大学, ブリストル, イギリス) を感謝したいです。この作業は、l. l. に国立の医療研究評議会 (ナノ材研/CBRG/007/2012 年)、文部省 (AcRF Tier1 RG 18/11、RG 48/13 と RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) からの助成金によって支えられました。
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
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