Kvantitativ lokalisering av et Golgi Protein av Imaging sin sentrum av fluorescens masse

Summary

Den nøyaktige lokaliseringen av Golgi beboere er avgjørende for å forstå Golgi cellulære funksjoner. Konvensjonelle optisk mikroskopi er imidlertid ikke klarer å løse sub-Golgi strukturen. Her beskriver vi protokollen for konvensjonelle mikroskopi basert super-oppløsning metode å avgjøre kvantitativt sub-Golgi lokalisering av et protein.

Abstract

Golgi komplekset består av serielt stablet membran cisternae som kan kategoriseres ytterligere i sub-Golgi regioner, inkludert cis-Golgi, mediale-Golgi, trans-Golgi og trans-Golgi nettverk. Cellulære funksjoner av Golgi bestemmes av karakteristiske fordelingen av sin bosatt proteiner. Den romlig oppløsningen på konvensjonelle * lys er for lavt løse sub-Golgi struktur eller cisternae. Dermed er elektronmikroskop immuno-gull en metode for valg å lokalisere et protein på sub-Golgi nivå. Teknikk og apparatet er imidlertid utover funksjonaliteten til de fleste celle biologi labs. Her beskriver vi vår nylig utviklede super-oppløsning metode kalt Golgi protein lokalisering av imaging senterne av masse (KYNDIG) å systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein. KYNDIG er basert på standard fluorescens merking protokoller og konvensjonelle wide-feltet eller AC confocal mikroskop. Det innebærer kalibrering av kromatisk-Skift avvik av mikroskopiske systemet, bilde oppkjøpet og etter oppkjøp analyse. Den sub-Golgi lokaliseringen av en test protein uttrykkes kvantitativt lokalisering kvotienten. Det er fire viktigste fordelene av KYNDIG; Det er rask, basert på konvensjonelle metoder og verktøy, lokalisering resultatet er kvantitative og den gir ~ 30 nm praktisk oppløsningen langs Golgi akse. Her beskriver vi detaljerte protokollen av KYNDIG å lokalisere en test Golgi protein.

Introduction

Golgi komplekset spiller viktige roller i sekretoriske/endocytic smugling av proteiner og lipider (heretter Last) i pattedyrceller^1,2,3. På Golgi, er Last ikke bare sortert til ulike sub mobilnettet rom men også endret av ulike typer glykosylering. Pattedyr Golgi komplekset består av mange lateralt tilkoblede Golgi stabler, som vanligvis består av 4-11 tett tilstøtende og flat membran sacs kalt cisternae. Serielt stablet Golgi cisternae kategoriseres ytterligere, fra den ene enden til den andre, som cis, mediale og trans-cisternae. På trans-side av en Golgi stabel, trans-de fleste membran sac utvikler seg til en rørformet og retikulum membran nettverk kalt trans-Golgi nettverk (TGN)⁴. I sekretoriske veien, Last avledet fra det endoplasmatiske retikulum (ER) Angi en Golgi stabel på sin cis-side og deretter sekvensielt passere gjennom mediale og trans-cisternae. Last til slutt avslutte Golgi på trans-Golgi eller TGN destining plasma membran, endosomes eller sekretoriske granulat.

Molekylære og cellulære mekanismer for hvordan cargos transitt en Golgi stabel og hvordan Golgi opprettholder sin cisternal organisasjon fortsatt mystisk og er fortsatt under en opphetet debatt¹. En av vanskelighetene i dette feltet er at Golgi cisternae kan bare løses under elektronmikroskop (EM) siden oppløsningen av en optisk mikroskopet (~ 200 nm) er tilstrekkelig for å løse enkelte Golgi cisternae (< 100 nm i begge cisternal tykkelse og avstand). Derfor den sub-Golgi lokaliseringen av bosatt proteiner og transiting cargos konvensjonelt bestemmes av immuno-gull EM. Men immuno-gull EM er svært teknisk krevende og det er utenfor evnen til de fleste celle biologi labs. Selv om oppløsningen av EM kan være sub nanometer, oppløsningen by av immuno-gull EM er sterkt hemmet av størrelsen på antistoffer komplekse (primær og sekundær antistoffer) og gull partikkelen, og det kan være verre enn 20 nm. Videre er EM bilder Hentet fra 2D tynn-deler i stedet for en 3D global oversikt over Golgi, som kan medføre feilaktige konklusjoner avhengig av relative posisjonen og orientering av 2D seksjon⁵. For eksempel, er studere en EM single-delen ikke pålitelig skille en vesicle fra ortogonale visning av en tubule siden begge kan vise identiske runde membran profiler. Det nylige advent super-oppløsning mikroskopi teknikker, for eksempel 3D-strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM), stimulert utslipp nedbryting (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) og Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi ( STORM), gjør det mulig å løse sub-Golgi strukturer under lys mikroskop⁶. Det er imidlertid minst fire ulemper som kan betydelig begrense bruksområdene i cellen biologiske studiet av Golgi. 1) gjeldende super-oppløsning teknikker krever dyre og spesielle maskinvarekonfigurasjon som er utenfor de fleste celle biologi labs. 2) spesielle fluorescens merking protokoller er nødvendig for noen super-oppløsning teknikker. 3) selv, under den beste tilstanden, disse teknikkene 20-110 nm i romlig oppløsning, kan praktisk oppløsningen innhentet i virkelige eksempler være mye verre. 4) i forhold til konvensjonelle mikroskopi, disse super-oppløsning teknikker fortsatt har problemer i å gjennomføre multicolor, 3D eller live celle imaging, enten enkeltvis eller kombinert. Sannsynligvis viktigst, gi både immuno-gull EM og super-oppløsning mikroskopi teknikker kvalitative stedet for kvantitative lokalisering data.

Prøver å delvis løse problemene nevnt ovenfor, har vi nylig utviklet en konvensjonell * lys basert metode, kalt Golgi protein lokalisering av imaging senterne av masse (KYNDIG), å systematisk og kvantitativt lokalisere en Golgi protein oppløsning som av immuno-gull EM⁷. I denne metoden er Golgi i kulturperler pattedyrceller spredt som Golgi mini-stabler ved behandling av nocodazole, en microtubule depolymerizing narkotika. Omfattende studier har vist at nocodazole-indusert Golgi mini-stakker (heretter Golgi mini-stabler) ligner innfødt Golgi stabler både organisasjonen og cellular funksjonene^{8,9,10, 11}. Lokalisering kvotienten (LQ) en test protein kan skaffes gjennom KYNDIG og betyr den kvantitative sub-Golgi lokaliseringen. De numeriske verdiene i LQs kan sammenlignes, og en LQ database med mer enn 25 Golgi markører er tilgjengelig.

I KYNDIG er Golgi mini-stabler trippel-merket av endogene eller exogenously uttrykt GM130, GalT-mCherry og test protein (x). GM130 og GalT-mCherry, cis– og trans-Golgi markører henholdsvis^12,13, gi referansepunkt. Den tredoble fluorescensen, rød (R), grønn (G) og langt rødt (B), kunstig vises som rød, grønn og blå, henholdsvis. Midten av fluorescens masse (heretter senter) er vedtatt for å oppnå sub pikslers oppløsning. Golgi aksen er definert som vektor fra midten av GM130 for GalT-mCherry. Golgi mini stakken er modellert som en sylindrisk struktur med uendelig rotational symmetri rundt Golgi aksen. Derfor kan en Golgi mini stabel videre modelleres som en endimensjonal langs Golgi aksen. LQ av testen protein x er definert som d_x/d₁, der d_x er avstanden fra sentrum av x som for GM130, mens d₁ er avstanden fra sentrum av GalT-mCherry for GM130. Hvis midten av x er off-aksen, brukes projeksjon aksial avstanden for beregning. Variablene, inkludert Golgi aksen, aksial vinkel, d_x, d₁, vinkel α og vinkel β, for KYNDIG illustrert skjematisk i figur 1. LQ er uavhengig av Golgi aksial vinkelen om Golgi mini-stabler orientere tilfeldig i en celle.

Golgi mini-stabler vises ikke-homogen i bilder. Vi utviklet tre kriterier for å velge analyzable Golgi mini-stabler for KYNDIG. 1) signal-til-støy forholdet kriteriet, der totalt intensiteten av en Golgi mini stabel til standardavviket (SD) for bakgrunnen er ≥ 30 i hver enkelt kanal. Dette kriteriet er å sikre at plassering av senteret av massen, som avhenger av signal-til-støy-forhold av Golgi mini-stabler. 2) aksial vinkelen eller avstanden kriteriet, som krever d₁≥ 70 nm. d₁ reduseres med økningen av Golgi aksial vinkelen. Når aksial vinkelen nærmer seg 90° eller vertikal, mini stakken blir ikke løses som d₁ nærmer seg 0. d₁≥ 70 nm kan effektivt ekskludere nær vertikale Golgi mini-stabler. 3) Ko-linearitet kriteriet, der enten | tan α | eller | tan β | er ≤ 0,3. Dette kriteriet sikrer at tre sentrene for en mini stabel er tilstrekkelig co-lineær for våre endimensjonal modellen av Golgi mini stabelen. Alle lys mikroskop lider kromatisk aberrasjon som kan alvorlig forvrenge de relative plasseringene til røde, grønne og langt rødt fluorescens sentre. Kromatisk aberrasjon mikroskop systemer er eksperimentelt kalibrert av imaging 110 nm perler, som trippel-merket av rød, grønn, langt rødt fluorescens. For hver perle bilde, sentrum av rødt er definert som den sanne plasseringen av perle og kromatisk-Skift av grønne og langt rødt sentrene utstyrt av første orden polynom funksjoner. Av Golgi mini-stabler er utsatt til polynom funksjoner å rette kromatisk-skift i grønt og langt rødt kanaler.

Gjennom KYNDIG vi kan oppnå en oppløsning på ~ 30 nm langs Golgi aksen under standard betingelser. Viktigere, gir det en systematical metode for å tilordne kvantitativt noen Golgi protein. KYNDIG kan utføres av konvensjonell mikroskop, som wide-feltet eller AC confocal mikroskoper, bruker vanlige fluorescens merking protokoller. Bildebehandling og databehandling kan ta idet kort idet for en time. Gjennom KYNDIG, vi har direkte viste progressiv overgangen av sekretoriske lasten fra cis– trans-side av Golgi⁷.

Protocol

Merk: Nedenfor er KYNDIG trinnvise protokollen for å bestemme LQ av EGFP-merket tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), en Golgi bosatt enzym, i jakten celler. 1. utarbeidelse av fluorescens-merket Golgi Mini-stabler Forberede glass coverslips Aliquot 0,3 mL steril Dulbecco endret Eagle’s Medium (DMEM) til et godt av en 24-vel plate i vev kultur hette. Slette et stykke Φ 12 mm No.1.5 glass dekkglassvæske med mykt papir dytter med 70% etano…

Representative Results

Moderne forskning klasse lys mikroskopet utstyrt med en plan apochromatic linse, som den som brukes i vår lab, viser minimal kromatisk aberrasjon (figur 2A). Men kan en nøye undersøkelse av multi-farge fluorescerende perle bildet avsløre skifte av annen fargebilder av samme perle (figur 2B). Vi definerer at den røde kanalen er kromatisk aberrasjon og derfor av røde fluorescens er sanne plas…

Discussion

Tidligere var lokalisering av et Golgi protein under * lys hovedsakelig kvantifisert ved sammenheng eller overlappende av bildet av protein med bildet av merketråd Golgi kjent lokalisering^{15,16, 17}. Den resulterende sammenheng eller overlappende koeffisienten gjenspeiler hvor nær testing protein er til Golgi merket romlig. Det er minst tre begrensninger for denne tilnærmingen. Først den sammenheng eller overlappende koeffis…

Materials

fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody