Localización cuantitativa de una proteína de Golgi por su masa centro de fluorescencia de imagen
Summary
La localización precisa de los residentes de Golgi es esencial para la comprensión de las funciones celulares de lo Golgi. Sin embargo, la microscopía óptica convencional es incapaz de resolver la estructura sub-Golgi. Aquí describimos el protocolo para un método de súper-resolución microscopia convencional basado determinar cuantitativamente la localización sub-Golgi de una proteína.
Abstract
El complejo de Golgi consta de cisternas apiladas en serie de membrana que pueden categorizarse aún más en las regiones sub-Golgi, incluyendo cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi y trans-red de Golgi. Funciones celulares de lo Golgi son determinadas por la distribución característica de sus proteínas residentes. La resolución espacial de microscopía óptica convencional es insuficiente para resolver la estructura sub-Golgi o cisternas. Así, la microscopía electrónica de inmuno-oro es un método de elección para localizar una proteína a nivel sub-Golgi. Sin embargo, la técnica y el instrumento están más allá de la capacidad de los laboratorios de biología celular la mayoría. Aquí describimos nuestro método de super-resolución recientemente desarrollado llamado localización de Golgi proteína por imágenes centros de masa (GLIM) sistemáticamente y cuantitativamente localizar una proteína de Golgi. GLIM se basa en protocolos de etiquetado estándar de fluorescencia y convencional campo amplio o microscopios confocales. Se trata de la calibración de la aberración cromática desplazamiento del sistema microscópico, la adquisición de la imagen y el análisis después de la adquisición. La localización de sub-Golgi de una proteína prueba cuantitativamente se expresa como el cociente de localización. Hay cuatro principales ventajas de GLIM; es rápida, basada en métodos convencionales y herramientas, el resultado de la localización es cuantitativo, y que ofrece ~ 30 resolución práctica de nm en el eje de Golgi. Aquí describimos el protocolo detallado de GLIM localizar una prueba de proteína de Golgi.
Introduction
El aparato de Golgi juega un papel esencial en el tráfico endocíticas/secretoras de proteínas y lípidos (en lo sucesivo cargos) en células de mamífero1,2,3. En el Golgi, cargas son no sólo ordenan a varios compartimientos celulares pero también modificados por diversos tipos de glicosilación. El complejo de Golgi mamífero comprende numerosas pilas de Golgi conectadas lateralmente, que típicamente consiste en 4-11 sacos de membrana firmemente junto y planos llamados cisternas. Las cisternas de Golgi apiladas en serie tienen más la categoría, de un extremo al otro, medial, cisy trans-cisternas. En el trans-lado de una pila del Golgi, trans-saco de membrana la mayoría se convierte en una red de membrana tubular y retículo llamada trans-red de Golgi (TGN)4. En la vía secretoria, cargas derivados del retículo endoplásmico (ER) Introduzca un stack de Golgi en su cis-lado y entonces pasan secuencialmente por medial y trans-cisternas. Cargos eventualmente salir de Golgi en el trans-Golgi o TGN destinando a la membrana plasmática, endosomas o gránulos secretores.
Los mecanismos moleculares y celulares de cómo cargas de tránsito un stack de Golgi y cómo el Golgi mantiene su organización cisternal siguen siendo misterios y actualmente todavía están en un acalorado debate1. Una de las dificultades en este campo es que cisternas de Golgi sólo pueden resolverse en la microscopia electrónica (EM) desde la resolución de un microscopio óptico (~ 200 nm) es insuficiente para resolver los cisternas de Golgi (< 100 nm en ambos grueso cisternal y la distancia). Por lo tanto, la localización sub-Golgi de proteínas residentes y cargas de tránsito se determinan convencionalmente por la EM de inmuno-oro. Sin embargo, el inmuno-oro EM muy técnicamente es exigente y está más allá de la capacidad de los laboratorios de biología celular la mayoría. Aunque la resolución de la EM puede ser sub-nanométrica, la resolución de la EM de inmuno-oro es obstaculizada grandemente por el tamaño del anticuerpo complejo (primaria más el anticuerpo secundario) y la partícula de oro, y puede ser peor que 20 nm. Además, se obtienen las imágenes de la EM de secciones delgadas 2D en lugar de una visión global 3D de Golgi, que puede dar lugar a conclusiones erróneas según la posición relativa y orientación de la sección 2D5. Por ejemplo, estudiar una única sección de la EM es incapaz de distinguir confiablemente una vesícula de la vista ortogonal de un túbulo puesto que ambos pueden mostrar perfiles idénticos de membrana redonda. El advenimiento reciente de técnicas de microscopía de superresolución, tales como microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM), estimuló el agotamiento de la emisión (STED), microscopía de localización fotoactivado (PALM) y estocástico reconstrucción óptica microscopia ( La tormenta), permite resolver las estructuras sub-Golgi en microscopios de luz6. Sin embargo, hay al menos cuatro desventajas que pueden limitar significativamente su uso en el estudio biológico de la célula del Golgi. 1) Super-resolución actual técnicas requieren configuración hardware caro y especial que está más allá de más laboratorios de biología celular. 2) protocolos de etiquetado fluorescencia especiales son necesarios para algunas técnicas de superresolución. 3) aunque, bajo las mejores condiciones, estas técnicas tienen 20-110 nm de resolución espacial, la resolución práctica obtenida en muestras reales puede ser mucho peor. 4) en comparación con microscopia convencional, estas técnicas de superresolución todavía tienen dificultades en la realización de multicolores, 3D o viven imágenes de celular, ya sea individualmente o en combinación. Probablemente lo más importante, inmuno-oro EM y las técnicas de microscopía de superresolución rendimiento cualitativo en vez de datos cuantitativos de localización.
Intentar solucionar parcialmente problemas mencionados anteriormente, recientemente hemos desarrollado un método de microscopía de luz convencional basado, que es el nombre de localización de Golgi proteína por imágenes centros de masa (GLIM), sistemáticamente y cuantitativamente localizar un Golgi proteína con una resolución equivalente a la de la inmuno-oro EM7. En este método, el Golgi en células mamíferos cultivadas se dispersa como mini-pilas de Golgi por el tratamiento de nocodazole, una droga despolimerizantes de microtúbulos. Estudios extensos han demostrado que inducida por nocodazole Golgi mini-pilas (en adelante mini-pilas de Golgi) asemejan nativas pilas de Golgi en la organización y las funciones celulares8,9,10, 11. El cociente de localización (LQ) de una proteína de prueba puede ser adquirido a través de GLIM y denota la localización sub-Golgi cuantitativa. Puede compararse con los valores numéricos de LQs y una base de datos LQ de más de 25 marcadores de Golgi ha estado disponible.
En GLIM, mini-pilas de Golgi son triple marcado por GM130 endógeno o exógeno expresado, mCherry GalT y la prueba de proteína (x). GM130 y GalT-mCherry, cis– y trans-marcadores de Golgi respectivamente12,13, proporcionar puntos de referencia. La fluorescencia triple, rojo (R), verde (G) y far-red (B), se muestran de forma artificial como rojo, verde y azul, respectivamente. Centro de masa de fluorescencia (en adelante centro) se adopta para lograr la resolución de sub-pixel. El eje de Golgi se define como el vector desde el centro de GM130 que mCherry GalT. La pila pequeña de Golgi se modela como una estructura cilíndrica con infinita simetría rotacional alrededor del eje de Golgi. Por lo tanto, una mini-pila de Golgi se puede modelar más como una estructura unidimensional en el eje de Golgi. LQ de la prueba de la proteína x se define como dx/d1, en el que dx es la distancia desde el centro de la x a la de GM130, d1 es la distancia desde el centro de GalT-mCherry de GM130. Si el centro de x fuera del eje, la distancia de proyección axial se utiliza para el cálculo. Las variables, incluyendo Golgi eje, ángulo axial, dx, d1, ángulo α y β del ángulo, GLIM se ilustran esquemáticamente en la figura 1. LQ es independiente del ángulo axial Golgi Aunque mini-pilas de Golgi se orientan aleatoriamente en una celda.
Mini-pilas de Golgi aparecen no homogéneas en imágenes. Hemos desarrollado tres criterios para seleccionar mini-pilas de Golgi analizables para GLIM. 1) el criterio de relación señal a ruido, en la que el cociente de la intensidad total de una mini-pila de Golgi a la desviación estándar (SD) del fondo es ≥ 30 en cada canal. Este criterio es asegurar la precisión del posicionamiento del centro de masa, que depende de los cocientes signal-to-noise de mini-pilas de Golgi. 2) el criterio ángulo o distancia axial, que requiere d1≥ 70 nm. d1 disminuye con el aumento del ángulo axial de Golgi. Cuando el ángulo axial se aproxima a 90 º o vertical, la mini pila llega a ser no puede resolver como d1 se acerca a 0. d1≥ 70 nm puede excluir con eficacia cerca vertical mini-pilas de Golgi. 3) el criterio de la colinealidad, en cual | tan α | o | tan β | es ≤ 0.3. Este criterio asegura que los tres centros de una pila de mini son suficientemente co-lineales para el modelo unidimensional de la pila pequeña de Golgi. Todos los microscopios ópticos sufren de aberración cromática que puede distorsionar seriamente las posiciones relativas de fluorescencia roja, verde y far-red centros. Aberración cromática de los sistemas del microscopio está calibrado experimentalmente por proyección de imagen 110 perlas de nm, que son triple marcado por fluorescencia roja, verde y far-red. Para cada imagen de grano, el centro de la red se define como la posición del talón y cromática-turnos de centros verdes y far-red están equipados de funciones polinómicas de primer orden. Centros de mini-pilas de Golgi están sujetos a las funciones polinómicas para corregir los cambios cromáticos-canales verdes y far-red.
A través de GLIM podemos alcanzar una resolución de ~ 30 nm en el eje de Golgi bajo condiciones estándar. Lo importante, proporciona un método sistemático para asignar cuantitativamente cualquier proteína de Golgi. GLIM puede realizarse por microscopios convencionales, como gran campo o microscopios confocales, con protocolos comunes de etiquetado de la fluorescencia. La proyección de imagen y procesamiento de datos pueden tomar tan cortos como una hora. A través de GLIM, hemos directamente demostrado la transición progresiva de la carga secretor de la cis– para trans-lado de la de Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Previamente, la localización de una proteína de Golgi en la microscopía se cuantificó principalmente por el grado de correlación o superposición de la imagen de la proteína con la imagen de un marcador de Golgi de localización conocidos15,16, 17. La correlación resultante o superposición coeficiente refleja cómo está cercano la proteína prueba es el marcador de Golgi espacial. Hay al menos tres advertencias para es…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a D. Stephens (Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido) por el plásmido de ADN TPST1-EGFP, como Lakshmi Narasimhan Govindarajan para ayudar con la optimización de software. Este trabajo fue financiado por becas del Consejo Nacional de investigación médica (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerio de Educación (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 y RG132/15 y AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) a L.L.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
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