Kvantitativa lokalisering av ett Golgi Protein av Imaging Center av fluorescens massan
Summary
Exakt lokalisering av Golgi invånare är viktigt för att förstå de cellulära funktionerna i Golgi. Konventionella optisk mikroskopi är dock inte kan lösa strukturen sub-Golgi. Här beskriver vi protokollet för en konventionell mikroskopi baserat super-resolution metod att kvantitativt bestämma sub-Golgi lokaliseringen av ett protein.
Abstract
Golgi komplexet består av seriellt staplade membran cisternae som ytterligare kan kategoriseras in i sub-Golgi regioner, inklusive cis-Golgi, mediala-Golgi, trans-Golgi och trans-Golgi nätverk. Cellulära funktioner av Golgi bestäms av karakteristiska fördelningen av dess hemvist proteiner. Den rumsliga upplösningen i konventionella ljusmikroskopi är för låg för att lösa sub-Golgi struktur eller cisternae. Den immuno-guld elektronmikroskopi är alltså en metod som väljer att lokalisera ett protein på sub-Golgi nivå. Teknik och instrument är dock utöver kapaciteten hos de flesta cellbiologi labs. Här beskriver vi vår nyutvecklade super-upplösning metod kallas Golgi protein lokalisering av imaging centra av massan (GLIM) för att systematiskt och kvantitativt lokalisera ett Golgi-protein. GLIM är baserad på standard fluorescens märkning protokoll och konventionella wide-fältet eller confocal Mikroskop. Det handlar om kalibrering av kromatisk-shift aberration av mikroskopiska systemet, bild förvärv och efter förvärvet analys. Sub-Golgi lokaliseringen av ett protein som test är kvantitativt uttryckt som lokalisering kvoten. Det finns fyra huvudsakliga fördelar med GLIM; Det är snabba, baserat på konventionella metoder och verktyg, lokalisering resultatet är kvantitativa och det ger ~ 30 nm praktisk upplösning längs Golgi-axeln. Här beskriver vi de detaljerade protokollet av GLIM att lokalisera ett test Golgi protein.
Introduction
Golgi komplexet spelar viktiga roller i sekretoriska/endocytic handel av proteiner och lipider (härefter cargos) i däggdjursceller1,2,3. På Golgi, är laster inte bara sorteras till olika sub cellulära fack men också av olika typer av glycosylation. Däggdjur Golgi komplexet består av ett flertal sido anslutna Golgi stackar, som vanligtvis består av 4-11 tätt intill och platt membran säckar kallas cisternae. De seriellt staplade Golgi-cisternae ytterligare kategoriseras, från ena änden till den andra, som cis, mediala och trans-cisternae. På den transen-sida av en Golgi stack, trans-de flesta membran sac utvecklas till ett nätverk för tubulär och nätmagen membran som kallas den transen-Golgi nätverk (TGN)4. Utsöndringsvägarna, laster som härrör från det endoplasmatiska retiklet (ER) ange en Golgi stack på dess cis-sida och sedan sekventiellt passera genom mediala och trans-cisternae. Cargos så småningom avsluta Golgi på trans-Golgi eller TGN destining till plasmamembranet, endosomes eller sekretoriska granuler.
De molekylära och cellulära mekanismerna för hur cargos transitering en Golgi stack och hur Golgi underhåller dess cisternal organisation förblir mystiska och är för närvarande fortfarande under en hetsig debatt1. En av svårigheterna på detta område är att Golgi cisternae endast kan lösas under elektronmikroskopi (EM) sedan upplösningen av ett optiskt mikroskop (~ 200 nm) är otillräckliga för att lösa enskilda Golgi cisternae (< 100 nm i båda cisternal tjocklek (och avstånd). Därför bestäms konventionellt sub-Golgi localizationen av bosatta proteiner och transit laster av immuno-guld EM. Men den immuno-guld EM är mycket tekniskt krävande och det är bortom kapaciteten hos de flesta cellbiologi labs. Även om upplösningen på EM kan vara sub nanometer, resolutionen ges av immuno-guld EM hämmas kraftigt av storleken av antikropp komplexa (primär samt sekundär antikroppen) och guld partikeln och det kan vara värre än 20 nm. Dessutom erhålls EM bilder från 2D tunn-avsnitten i stället för en 3D övergripande bild av den Golgi, vilket kan resultera i felaktiga slutsatser beroende på den relativa position och orientering av 2D avsnitt5. Studera ett EM singel-avsnitt är exempelvis inte kan på ett tillförlitligt sätt skilja en vesikler från ortogonala beskåda av en tubuli eftersom båda kan visa identiska runda membran profiler. Senaste tillkomsten av super-resolution mikroskopi tekniker, såsom 3D-strukturerade belysningen mikroskopi (3D-SIM), stimulerat utsläpp utarmning (STED), photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi ( STORM), gör det möjligt att lösa sub-Golgi strukturer under ljus Mikroskop6. Men finns det minst fyra nackdelar som avsevärt kan begränsa deras användning i cell biologiska studier av Golgi. (1) nuvarande super-upplösning tekniker kräver dyra och särskilda maskinvarukonfiguration som är bortom de flesta cellbiologi labs. (2) särskilda fluorescens märkning protokoll behövs för några super-upplösning-tekniker. (3) även om, enligt bästa skick, hävdar dessa tekniker 20-110 nm i rumslig upplösning, kan den praktiska resolution erhållits i riktiga prover vara mycket värre. (4) i jämförelse med konventionella mikroskopi, dessa super-upplösning tekniker fortfarande har svårigheter att bedriva multicolor, 3D eller live cell imaging, antingen ensamma eller i kombination. Förmodligen viktigast av allt, både immuno-guld EM och super-resolution mikroskopi teknikerna ger kvalitativa i stället för kvantitativa localization data.
Försök att delvis lösa problem som nämns ovan, har vi nyligen utvecklat en konventionell ljusmikroskopi baserat metod, som heter Golgi protein lokalisering av imaging centra av massan (GLIM), att systematiskt och kvantitativt lokalisera en Golgi protein med en upplösning som är likvärdig med den immuno-guld EM7. Den här metoden är Golgi hos odlade däggdjursceller utspridda som Golgi mini-stackar genom behandling av nocodazole, en mikrotubulära depolymerizing drog. Omfattande studier har visat att nocodazole-inducerad Golgi mini-stackar (härefter Golgi mini-stackar) liknar infödda Golgi stackar i både organisation och cellulära funktioner8,9,10, 11. Lokalisering kvoten (LQ) av en test-protein kan förvärvas genom GLIM och det betecknar den kvantitativa sub-Golgi lokaliseringen. De numeriska värdena av LQs kan jämföras och en LQ databas med mer än 25 Golgi markörer har varit tillgänglig.
I GLIM är Golgi mini-stackar triple-märkt av endogent eller exogent uttryckt GM130, GalT-mCherry och proteinet test (x). GM130 och GalT-mCherry, cis– och trans-Golgi markörer respektive12,13, tillhandahålla referenspunkter. Den trippel fluorescensen, röd (R), grönt (G) och mån B, artificiellt visas som rött, grönt och blått, respektive. Masscentrum fluorescens (härefter center) antas för att uppnå sub PIXELupplösning. Golgi axeln definieras som vektorn från centrum av GM130 med GalT-mCherry. Golgi mini stacken modelleras som en cylindrisk struktur med oändlig rotational symmetri runt Golgi-axeln. Därför kan en Golgi mini stack modelleras vidare som en endimensionell struktur längs Golgi-axeln. LQ av proteinet test x definieras som dxd1, där dx är avståndet från mitten av x som GM130, medan d1 är avståndet från centrum av GalT-mCherry med GM130. Om x ligger off-axeln, används dess axiella Projiceringsavstånd för beräkningen. Variabler, inklusive Golgi axis, axiell vinkel, dx, d1, vinkeln α och vinkeln β, för GLIM illustreras schematiskt i figur 1. LQ är oberoende av Golgi axiell vinkel men Golgi mini-stackar orientera slumpmässigt i en cell.
Golgi mini-stackar visas inhomogena i bilder. Vi utvecklat tre kriterier för att välja analyserbart Golgi mini-stackar att GLIM. (1) signal-brusförhållande kriteriet, där förhållandet mellan den totala intensiteten av en Golgi mini stack att standardavvikelsen (SD) för bakgrunden är ≥ 30 i varje kanal. Detta kriterium är att säkerställa positionering riktigheten av centrum av massan, som beror på de signal-brus-förhållanden av Golgi mini-stackar. (2) axiell vinkel eller avstånd kriteriet, som kräver d1≥ 70 nm. d1 minskar med ökningen av Golgi axiell vinkel. När axiell vinkel närmar sig 90° eller vertikal, mini stacken blir icke-matchas som d1 närmar sig 0. d1≥ 70 nm kan effektivt utesluta nära vertikala Golgi mini-stackar. (3) co-linjäritet kriteriet, i vilken antingen | tan α | eller | tan β | är ≤ 0,3. Detta kriterium säkerställer att de tre centra för en mini stack är tillräckligt co-linjär för vår endimensionell modell av Golgi mini stacken. Alla ljus Mikroskop lider kromatisk aberration som kan allvarligt snedvrida de relativa positionerna för rött, grönt och mån fluorescens centra. Kromatisk aberration av Mikroskop system är experimentellt kalibrerad av imaging 110 nm pärlor, som är triple-märkt av röda, gröna och mån fluorescens. För varje pärla bild, centrera av röda definieras som pärlan sanna position och kromatiska-förskjutningar av grön- och mån monteras av första ordningens polynom functions. Centrerar av Golgi mini-stackar utsätts för polynom funktioner att korrigera kromatisk-Skift i grönt och mån kanaler.
Genom GLIM kan vi uppnå en upplösning på ~ 30 nm längs Golgi axeln under standart villkorar. Ännu viktigare, ger det en systematisk metod för att kvantitativt karta något Golgi-protein. GLIM kan utföras av konventionella Mikroskop, till exempel wide-fält eller confocal Mikroskop, använder gemensamma fluorescens märkning protokoll. Den imaging och databehandling kan ta så kort som en timme. Genom GLIM, vi har direkt visat den progressiva övergången av sekretoriska lasten från cis– till trans-sida av Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokaliseringen av ett Golgi protein under ljusmikroskopi kvantifierades tidigare, främst av graden av korrelation eller överlappande bilden av proteinet med bilden av en Golgi markör kända lokalisering15,16, 17. Den resulterande korrelation eller överlappande koefficient återspeglar hur nära testning proteinet är till Golgi markör rumsligt. Det finns minst tre varningar för detta tillvägagångssätt. Först den korre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka D. Stephens (University of Bristol, Bristol, Storbritannien) för såväl TPST1-andra DNA plasmid, som Lakshmi licette Gun för att hjälpa till med optimering programvara. Detta arbete stöds av bidrag från de nationella medicinska forskningsrådet (NMRC-CBRG-007/2012), Undervisningsministeriet (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 och RG132/15 och AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) till L.L.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
Referências
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
