Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת
Summary
כתב יד זה מציג שיטות לניתוח morphometric, שינויים סלולריים בתוך בעצם הלסת של מכרסמים.
Abstract
מפרק לסתי-רקתי (TMJ) יש את היכולת להסתגל לגירויים חיצוניים, טעינת שינויים יכול להשפיע על המיקום של condyles, כמו גם את הרכיבים הסלולר מבניים של הסחוס condylar mandibular (MCC). כתב יד זה מתאר שיטות לניתוח שינויים אלה, שיטה לסירוס ועיקור הטעינה של למפרק לסתי-רקתי בעכברים (קרי, compressive סטטי TMJ טעינה). ההערכה מבניים מאויר כאן היא גישה פשוטה morphometric משתמשת התוכנה Digimizer, מבוצע במסגרת צילומי רנטגן של עצמות קטנות. בנוסף, הניתוח של הסלולר משתנה מובילים שינויים בביטוי קולגן, עצם שיפוץ, חלוקת התא, הפצה פרוטאוגליקן MCC מתואר. כימות של שינויים אלה בסעיפים היסטולוגית – על ידי ספירת הפיקסלים פלורסנט חיובי באמצעות תמונה תוכנה ומדידת מרחק המיפוי והמוכתמות אזור עם Digimizer – גם הוכח. השיטות המוצגות כאן אינם מוגבלים למפרק לסתי-רקתי מאתר, אך יכול לשמש על נוספים עצמות של חיות ניסוי קטן ובאזורים אחרים של התקשות endochondral.
Introduction
למפרק לסתי-רקתי ג’וינט-נושאת ייחודי הממוקם באזור ואסטתיים, בנוי fibrocartilage. MCC של למפרק לסתי-רקתי הוא חיוני עבור תפקוד המפרקים, כולל תנועת הלסת בוויטנברג באין מפריע תוך כדי דיבור, masticating, אבל זה מושפע בדרך כלל מחלות ניווניות, כולל דלקת מפרקים ניוונית1. למפרק לסתי-רקתי יש את היכולת להסתגל לגירויים חיצוניים והשינויים הטעינה, מובילים לשינויים מבניים הסלולר הרכיבים של4,53,2,MCC. מאפייני-נושאת MCC יכולה להיות מוסברת על ידי האינטראקציות בין המרכיבים שלה, כולל מים, הרשת קולגן, וארזו בצפיפות proteoglycans. MCC ה יש ארבעה אזורי הסלולר ברורים המבטאים סוגים שונים של קולגן, הלא-קולגן חלבונים: 1) לאזור שטחית או במפרק; 2) אזור המקדימות, מורכב של תאים mesenchymal מובחן זה מגיב טעינת דרישותיהם; 3) אזור prehypertrophic, המורכבת chondrocytes בוגרת לבטא קולגן מסוג 2; . ו-4) הסתיידות באזור, האזור בו chondrocytes היפרטרופית לבטא קולגן להקליד 10 אמות ומבצעת היפרטרופית. האזור הלא-על בסיס מינרלים מן הוא עשיר proteoglycans המספקים עמידות בפני כוחות compressive6.
. יש רציף מינרליזציה באיזור היפרטרופית של מפקד צוות משימה, שבו מתרחש המעבר chondrogenesis פרכת, המבטיח המבנה מינרל עמיד של עצם subchondral של בעצם הלסת7. שינויים סלולריים באזורים unmineralized, על בסיס מינרלים מן בסופו של דבר להוביל שינויים מבניים מורפולוגיים בעצם הלסת, לסת תחתונה. תחזוקת הומאוסטזיס בכל אזורי הסלולר MCC, את מינרליזציה של החלק subchondral חיוניים לבריאות, תומך קיבולת ותקינות למפרק לסתי-רקתי.
המודל העכבר הטרנסגניים מרובים קולגן (כמתואר על-ידי. Utreja et al.) 8 הוא כלי נהדר לשימוש להבין שינויים בביטוי קולגן כי כל transgenes באים לידי ביטוי MCC. עבור הערכה היסטולוגית מעמיק, כתמי היסטולוגית משמשים ללמוד מטריקס התצהיר, מינרליזציה, התפשטות תאים, אפופטוזיס, וכן ביטוי חלבון שכבות תאים שונים MCC.
זה כתב היד, היסטולוגית וניתוחים morphometric משמשים להעריך את השינויים תאיות בעצם MCC ו- subchondral של בעצם הלסת של עכברים. בנוסף, שיטת כימות תא, עבור ניתוח תמונות היסטולוגית פלורסנט, מיפוי שקופיות מיקרוסקופ אור, מתואר. לסתי סטטי compressive העמסת שיטה, אשר גורמת שינויים מורפולוגיים הסלולר MCC ו- subchondral עצם9, מומחש גם כדי לאמת את השיטות שלנו.
ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לקבוע morphometric ושינויים היסטולוגית בעצם הלסת, לסת תחתונה של מכרסמים או כדי לנתח את האזורים האחרים של התקשות endochondral ואת המורפולוגיה של רקמות על בסיס מינרלים מן נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה תיאר שיטות morphometric מדידה וניתוח הסלולר של מאתר condyles mandibular הלסת. המדידות morphometric רדיוגרפי יכול לשמש גם כדי לנתח אחרים עצמות של חיות ניסוי קטן. בנוסף, הניתוח הסלולר (כימות תא ומיפוי הסחוס מרחק) אינם מוגבלים מכרסם בעצם הלסת, אך יכול לשמש כדי לכמת מקטעים היסטולוגית של רקמות רבות.
<p class="…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות ד ר דוד רואו מתבקשים לספק את העכברים הטרנסגניים Li Chen על הסיוע היסטולוגית.
המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי את נבחרת המכון של שיניים ותחקיר ואסטתיים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר K08DE025914 על ידי האמריקאי האגודה של אורתודונטי לקרן Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Referências
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
