Un método de análisis celular para el cóndilo Mandibular murino y morfométricos
Summary
Este manuscrito presenta métodos para el análisis morfométrico y cambios celulares en el cóndilo mandibular de roedores.
Abstract
La articulación temporomandibular (ATM) tiene la capacidad de adaptarse a estímulos externos, y cambios de carga puede afectar la posición de los cóndilos, así como los componentes celulares y estructurales del cartílago condilar mandibular (MCC). Este manuscrito describe métodos para el análisis de estos cambios y un método para alterar la carga de la ATM en ratones (es decir, a la compresión estática ATM carga). La evaluación estructural ilustrada aquí es un enfoque morfométrico simple que utiliza el software Digimizer y se realiza en las radiografías de huesos pequeños. Además, el análisis de celulares cambia principales alteraciones en la expresión de colágeno, el remodelado óseo, la división celular y se describe la distribución de proteoglicanos en el MCC. La cuantificación de estos cambios en las secciones histológicas – contando los pixeles fluorescentes positivos utilizando software y la cartografía de la distancia de medición de la imagen y manchado la zona con Digimizer – también se demuestra. Los métodos que se muestran aquí no están limitados a la ATM murina, pero podrían ser utilizados en los huesos más pequeños de animales de experimentación y en otras regiones de la osificación endocondral.
Introduction
La ATM es una articulación de carga única situada en la región craneofacial y está formada por fibrocartílago. El MCC de la ATM es esencial para la función de las articulaciones, incluyendo movimiento de mandíbula sin trabas al hablar y masticar, pero comúnmente es afectado por enfermedades degenerativas, incluyendo artrosis1. La ATM tiene la capacidad de adaptarse a estímulos externos y alteraciones de la carga, conduce a cambios estructurales y celulares para los componentes del MCC2,3,4,5. Las propiedades de carga de la MCC se pueden explicar por las interacciones entre sus componentes, incluyendo el agua, la red de colágeno y densamente poblado de proteoglicanos. El MCC tiene cuatro zonas de celulares distintas que expresan diferentes tipos de proteínas no colágeno y colágeno: 1) la zona superficial o articular; 2) la zona proliferativa, compuesto por células mesenquimales indiferenciadas y responde a la carga de demandas; 3) la zona de prehypertrophic, compuesto por condrocitos maduros expresan colágeno de tipo 2; y 4) la hipertrófica de la zona, la región donde los condrocitos hipertróficos expresan colágeno tipo mueren 10 y someterse a la calcificación. La región no mineralizado es rica en proteoglicanos que ofrecen resistencia a fuerzas de compresión6.
Existe mineralización continua en la zona hipertrófica de la MCC, donde se produce la transición de condrogénesis osteogénesis, garantizando la robusta estructura mineral del hueso subcondral del cóndilo mandibular7. Cambios celulares en las regiones mineralizadas y no mineralizadas en última instancia conducen a cambios morfológicos y estructurales en el cóndilo mandibular y la mandíbula. Mantenimiento de la homeostasis de todas las regiones celulares del MCC y la mineralización de la porción subcondral son esenciales para la salud, capacidad de carga e integridad de la ATM.
El modelo de ratón transgénico de colágeno múltiple (según lo descrito por Utreja et al.) 8 es una gran herramienta para entender los cambios en la expresión de colágeno porque todos los transgenes se expresan en el MCC. Para una evaluación histológica a fondo, manchas histológicas se utilizan para estudiar la deposición de matriz, mineralización, proliferación celular y apoptosis, así como expresión de la proteína en las diferentes capas del MCC.
En este manuscrito, histológico y análisis morfométrico se utilizan para evaluar los cambios celulares y estructurales en el MCC y subcondral del hueso del cóndilo mandibular de los ratones. Además, se describe un método de cuantificación de células, para el análisis de imágenes histológicas fluorescentes y para el mapeo de portaobjetos de microscopio de luz. La resistencia a la compresión ATM estática carga del método, que causa cambios celulares y morfológicos en el MCC y subcondral hueso9, se ilustra también para validar nuestros métodos.
Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para determinar la morfometría y cambios histológicos en el cóndilo mandibular y la mandíbula de roedores o analizar otras regiones de la osificación endocondral y la morfología de los tejidos mineralizados adicionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe métodos para la medición morfométrica y análisis celular de cóndilos mandibulares murinos y mandíbulas. Las mediciones radiográficas morfométricas también pueden utilizarse para analizar otros huesos de animales pequeños. Además, el análisis celular (celular cuantificación y mapeo de distancia cartílago) no se limitan a cóndilo mandibular roedor, pero puede utilizarse para cuantificar las secciones histológicas de numerosos tejidos.
Modelos de ratón tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Dr. David Rowe por amablemente que los ratones transgénicos y Li Chen la asistencia histológica.
La investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Dental & investigación craneofacial de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número K08DE025914 y por la Asociación Americana de ortodoncia Fundación a Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Referências
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