En Morphometric og mobilnettet analysemetode for Murine Mandibular Condyle
Summary
Dette manuskriptet presenterer metoder for å analysere morphometric og mobilnettet endringer i den mandibular condyle av gnagere.
Abstract
Kjeveledd (TMJ) har kapasitet til å tilpasse seg ytre stimuli, og lasting endringer kan påvirke plasseringen av Kondyler og strukturelle og cellulær komponentene av mandibular condylar brusk (MCC). Dette manuskriptet beskriver metoder for å analysere disse endringene og en metode for å endre lasting av TMJ i mus (dvs. kompresjons statisk TMJ lasting). Strukturelle evalueringen illustrert her er en enkel morphometric tilnærming som bruker Digimizer programvare og utføres i røntgenbilder av små bein. I tillegg analyse av mobilnettet endres fører til endringer i kollagen uttrykk, ubalanse, celledeling, og proteoglycan distribusjon i MCC er beskrevet. Kvantifisering av endringene i histologiske seksjoner – ved å telle de positive fluorescerende bildepunktene med programvare og måle avstanden tilordningen og farget området med Digimizer – er også demonstrert. Metodene vises her er ikke begrenset til den murine TMJ, men kan brukes på flere bein av små forsøksdyr og i andre regioner i endochondral forbening.
Introduction
TMJ er en unik bærende felles ligger i craniofacial regionen og er dannet av fibrocartilage. MCC av TMJ er avgjørende for felles funksjon, inkludert uhindret kjeven bevegelse mens snakker og masticating, men det påvirkes vanligvis av degenerative sykdommer, inkludert slitasjegikt1. TMJ har kapasitet til å tilpasse seg eksterne stimuli og lasting endringer, fører til strukturelle og cellulær endringer i komponentene av MCC2,3,4,5. Bærende egenskapene til MCC kan forklares av samspillet mellom dens bestanddeler, inkludert vann, kollagen nettverket, og tett pakket proteoglycans. The MCC har fire forskjellige mobilnettet soner som uttrykker forskjellige typer kollagen og ikke-kollagen proteiner: 1) articular eller overfladiske sonen; 2) proliferativ sonen består av udifferensierte mesenchymal celler og som svarer til lasting krav; 3) de prehypertrophic sonen, består av modne chondrocytes uttrykke kollagen type 2; og 4) den hypertrofisk sone, regionen der de hypertrofisk chondrocytes uttrykke kollagen skriver 10 dø og gjennomgå forkalkninger. Ikke-mineraliserte regionen er rik på proteoglycans som gir motstand mot kompresjons styrker6.
Det er kontinuerlig mineralisering på hypertrofisk zone av MCC, der overgangen fra chondrogenesis til osteogenesis oppstår, garanterer robust mineral strukturen i subchondral bein av mandibular condyle7. Mobilnettet endringer i regionene unmineralized og mineralholdig til slutt føre til morfologiske og strukturelle endringer i mandibular condyle og kjeven. Vedlikehold av homeostase av alle mobilnettet regioner av MCC og mineraliseringen av delen subchondral er avgjørende for helse, bæreevne og integriteten til TMJ.
Flere kollagen transgene musemodell (som beskrevet av Utreja et al.) 8 er en stor verktøyet å bruk å forstå endringer i kollagen uttrykk fordi alle effekter av transgener uttrykkes i MCC. For en grundig histologiske evaluering brukes histologiske flekker å studere matrix deponering, mineralisering, celle spredning, og apoptose, samt protein uttrykk på ulike celle lag av MCC.
I dette brukes manuskriptet, histologiske og morphometric analyser til å evaluere mobilnettet og strukturelle endringer i MCC og subchondral Ben av det mandibular condyle mus. I tillegg er en celle kvantifisering metode, analysere fluorescerende histologiske bilder og kartlegging lys objektglass, beskrevet. Den kompresjons statisk TMJ lasting metoden, som fører til mobilnettet og morfologiske endringer på MCC og subchondral bein9, er også illustrert for å validere våre metoder.
Metodene som er beskrevet her kan brukes til å fastslå morphometric og histologiske endringer i mandibular condyle og kjeven av gnagere eller analysere andre områder av endochondral forbening og morfologi av ekstra mineralholdig vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet beskrevet metoder for morphometric måling og mobilnettet analyse av murine mandibular Kondyler og Accolade. Røntgen morphometric målinger kan også brukes til å analysere andre bein fra experimental smådyr. I tillegg cellular analyse (celle kvantifisering og brusk avstand kartlegging) er ikke begrenset til den gnager mandibular condyle, men kan brukes å kvantifisere histologiske deler av mange vev.
Transgene musen modeller uttrykker fluorescerende journalister er gode …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Dr. David Rowe for vennlige gir transgene mus og Li Chen for histologiske hjelp.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute for Dental & Craniofacial forskning av National Institutes of Health under prisen nummer K08DE025914 og av American Association for ortodontiske Foundation til Sumit Yadav.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
Referências
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
