赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出
Summary
ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。
Abstract
不完全なキメリズムの存在は、鎌状赤血球症やサラセミア メジャーの骨髄移植後の患者の大きい割合で示されます。この観測は、以降治療免疫戦略は、臨床結果を改善することができます大きな影響です。従来、短いタンデム繰り返しのポリメラーゼ連鎖反応に基づく解析を使用して、ドナー血液細胞のキメリズムを識別します。ただし、このメソッドは、有核細胞に制限されて、解離の単一セル血統を区別できません。フローサイトメトリーによるソートの造血前駆細胞を流れる短いタンデム繰り返しの解析を適用し、骨採集両方選択したバースト形成ユニット – 赤芽球コロニーから得られた短いタンデム繰り返しの分析とこれを比較して骨髄。この方法で我々 は異なる増殖と赤芽球のコンパートメントのドナー細胞の分化を実証することが。この技術は現在設定幹細胞移植におけるキメリズムの監視を完了する資格が、将来的に臨床応用の研究、幹細胞研究と遺伝子治療臨床試験のデザインになる可能性があります。
Introduction
同種造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) はさまざまな高い危害の無病生存率 90% 以上を達成するため、造血系の先天性の遺伝疾患でのみ利用可能な治癒アプローチと人生限られた患者1。この重要な治療ツールの有効性は、制限前の毒性によって最適化されている-レジメン2、移植後、閉じるモニタリングによる定量化は、安定した機能を維持を目的とした介入によってもドナー由来細胞の3,の4,5。
一般に、完全キメリズム (CC) ドナー由来細胞によるリンパ ・血液新生コンパートメントの総入れ替えを意味混合キメリズム (MC) という用語は、ドナーと受信者由来細胞が様々 な同時に存在する場合に使用されます。プロポーション。分割キメリズム (SC) は、赤芽球のコンパートメントで単一細胞系統の観察混合キメリズムの共存を示します。造血幹細胞移植後キメリズム ステータスの迅速定量は病気再発と開始以降免疫調節戦略、ドナーのリンパ球輸注や免疫抑制の減少などの影響を受けやすい患者を識別することがありますので、重要です。治療6。
いくつかの方法は、造血幹細胞移植後の生着を監視するために開発されています。免疫グロブリンのアイソタイプ識別と細胞遺伝学の分析感度が悪いとポリモーフィズム7、8を検出する機能が制限されます。蛍光その場で交配 (魚) の導入は、造血幹細胞移植後キメリズムのモニタリングで感度を向上させることができますが、セックスの不一致移植9に制限されています。現在、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のキメリズムの検出に使われる最も普及している方法で、変数数タンデム繰り返し (繰り返し) の従来の agarose アクリルアミド電気泳動に基づくまたは短いタンデム繰り返し (Str)。日常的に使用される量的な PCR は造血幹細胞移植に続く残留ドナー細胞の非常に小さい割合を検出することができます。研究の主な制限は、これまでのところは、MC 検出が成熟した赤血球は有核の細胞の存在にほとんど専ら制限されて、すなわち細胞が患者の機能的に重要な発生する赤血球の溶血です。顕解析は c、D、E、および e10赤血球抗原 ABO と C に向けモノクローナル抗体を用いた赤色の血液細胞のキメリズムを識別することを思い出して価値がある別の血液型と患者の,11. 赤芽球系列のキメリズムの評価の異なる、しかし、非常に興味深い手段は流れフローサイトメトリーは、クローンのアッセイでの培養赤芽球系前駆細胞と赤芽球前駆細胞の様々 な種類の選択の並べ替えの組み合わせSTR12の分析が続きます。このアプローチは、赤芽球コンパートメントでドナーと受信者のキメリズムの相対的な割合を計測することは、骨髄移植を維持するために戦略に活用することがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在の研究の目的は、赤血球の溶血の治療を受けた次の造血幹細胞移植患者における赤芽球前駆細胞のドナー/受信者キメリズムの分析のための 2 つの方法を組み合わせて観客を提供するためにある: 1.) 蛍光活性化細胞ソーティング造血前駆細胞の骨髄サンプル短いタンデム繰り返しの 2 分析続く。)コロニー形成単位の成長, 骨髄細胞の前駆細胞各種におけるコロニーの分類は続く短いタンデ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Kinderkrebshilfe Regenbogen スッドチロルによって支えられました。
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Referências
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