reprogramming प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं एक्सो में Pluripotency करने के लिए-मुक्त शर्तों
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के reprogramming में प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर एक गैर एकीकृत episomal दृष्टिकोण पूरी तरह से रासायनिक परिभाषित शर्तों में । निष्कर्षण, संस्कृति, reprogramming, और कड़े तरीकों द्वारा परिणामी प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन की प्रक्रिया विस्तृत रहे हैं ।
Abstract
ऑटोलॉगस सेल आधारित चिकित्सा प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की शुरूआत के साथ एक वास्तविकता के करीब कदम मिला । इस तरह के एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के रूप में भ्रूण स्टेम सेल, ऊतक इंजीनियरिंग में वादा के साथ और भविष्य बाल चिकित्सा हस्तक्षेप और स्टेम सेल बैंकिंग के लिए iPSC में reprogramming के लिए एक अद्वितीय प्रकार के विभेदित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को निकालने और संवर्धन प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं और उत्पादन episomal प्रेरित pluripotent इन कोशिकाओं से पूरी तरह से रासायनिक परिभाषित संस्कृति में स्टेम कोशिकाओं के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन मानव संयोजक vitronectin और E8 माध्यम का उपयोग शर्तें । नई लाइनों के लक्षण-प्रवाह cytometry, फोकल इमेजिंग, टेराटोमा गठन और transcriptional profiling-के कड़े तरीकों को लागू करने से वर्णन भी वर्णित है । नव जनित लाइनों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के एक्सप्रेस मार्करों-Oct3/4a, Nanog, Sox2, तर्-1-60, तर्-1-81, SSEA-4-जबकि SSEA-1 मार्कर के लिए नकारात्मक जा रहा है । स्टेम सेल लाइनों फार्म teratomas में scid-बेज रंग चूहों में 6-8 सप्ताह और teratomas सभी तीन रोगाणु परतों के ऊतकों प्रतिनिधि होते हैं । Transcriptional वैश्विक अभिव्यक्ति microarray डेटा प्रस्तुत करने के द्वारा लाइनों की रूपरेखा एक bioinformatic pluripotency मूल्यांकन एल्गोरिथ्म समझा सभी लाइनों pluripotent और इसलिए, इस दृष्टिकोण पशु परीक्षण के लिए एक आकर्षक विकल्प है । नई iPSC लाइनें आसानी से बहाव में भिंनता और ऊतक इंजीनियरिंग के अनुकूलन शामिल प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की प्रौद्योगिकी (iPSC) संभावित सेल प्रतिस्थापन उपचार, रोग और विकासात्मक मॉडलिंग के बारे में लाता है, और दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग1,2,3। प्रतिस्थापन चिकित्सा वैचारिक रूप से सेल इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इन-विट्रो विभेदित ऊतक (जैसे कार्डियक पैच के रूप में) आरोपण, या ऊतक इंजीनियरिंग के माध्यम से निर्देशित पुनर्जनन. एमनियोटिक द्रव (AFSC) और झिल्ली स्टेम सेल (AMSC) इन उपायों के लिए या तो सीधे4,5,6,7 या reprogramming के लिए एक प्रारंभिक सेल जनसंख्या के रूप में कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट स्रोत है pluripotency8,9,10,11,12में ।
प्रारंभिक दृष्टिकोण अपरिभाषित संस्कृति प्रणालियों या reprogramming तरीकों कि constructs9,10,11,12के जीनोमिक एकीकरण की आवश्यकता का इस्तेमाल किया । एक और हाल ही में अध्ययन एक एक्सो मुक्त माध्यम कार्यरत है, भले ही एक कम परिभाषित तहखाने झिल्ली लगाव मैट्रिक्स (बीएमएम), एमनियोटिक द्रव उपकला कोशिकाओं से iPSC उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, टेराटोमा गठन परख के साथ अध्ययन में शामिल नहीं था की एक धन के साथ इन विट्रो और आणविक डेटा । एमनियोटिक द्रव उपकला कोशिकाओं को एक मोटे तौर पर 8 गुना उच्च reprogramming क्षमता है जब नवजात fibroblasts13की तुलना में पाया गया । एक अंय अध्ययन में, mesenchymal एमनियोटिक द्रव से स्टेम कोशिकाओं को भी iPSC में एक बहुत उच्च दक्षता के साथ reप्रोग्राम किया जा पाया गया12।
Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के ऊतकों सभी 3 रोगाणु परतों के प्रतिनिधि में विभेदित किया जा सकता है और इस तरह व्यापक क्षमता है । बाल चिकित्सा रोगियों को फसल कटाई, reprogramming, और उनके ऑटोलॉगस एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के जंम के पूर्व और एमनियोटिक झिल्ली स्टेम सेल perinatally से लाभ हो सकता है । इसके अलावा, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के अपेक्षाकृत कम स्तर (वयस्क स्टेम सेल14,15) सैद्धांतिक रूप से iPSC16में स्रोत कोशिकाओं से epigenetic पूर्वाग्रह का स्वीकार्य प्रतिधारण को संबोधित करने में सहायता कर सकता है ।
यहाँ हम संयोजक vitronectin17 (VTN) episomal plasmids18का उपयोग करने पर रासायनिक रूप से परिभाषित एक्सो-मुक्त E8 माध्यम में pluripotency करने के लिए एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । reprogramming के लिए कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं का मुख्य लाभ उनकी उपलब्धता पूर्व में निहित है और perinatally और इस प्रकार इस दृष्टिकोण मुख्य रूप से बाल चिकित्सा ऊतक इंजीनियरिंग में अनुसंधान लाभ होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूण स्टेम सेल से iPSC पीढ़ी के प्रारंभिक चरण में भ्रूण के ऊतकों से स्रोत कोशिकाओं की निकासी, उनकी संस्कृति, विस्तार, और episomal reprogramming plasmids की शुरूआत पर जोर देता है । इस चरण के बाद लगभग 14-18 दिनों की संस्कृति अवधि क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के शौकीनों Medizinische Forschung ने ज्यूरिख विश्वविद्यालय, ज्यूरिख विश्वविद्यालय के Forschungskredit में समर्थित किया गया था, एनएमएस १०.२१६ और १२.१७६ के तहत SCIEX फैलोशिपCh , कार्डियोलोजी के स्विस सोसायटी, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान अनुदान के तहत फाउंडेशन [320030-122273] और [310030-143992], 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम, जीवन वाल्व, यूरोपीय आयोग अनुदान के तहत [२४२००८], ओल्गा Mayenfisch फाउंडेशन, EMDO फाउंडेशन, शुरू अनुदान २०१२ विश्वविद्यालय अस्पताल ज्यूरिख के, और मिशेल कैंसर संस्थान की आंतरिक फंडिंग ।
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
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