Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина
Summary
Мы представляем протокол, основанный на фильтрации, для выделения высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы скрещивания, в результате чего мы устраняем необходимость в ультрацентрифугировании, что делает его легко применимым. Мы показываем, что хроматин, полученный из ядер, подходит для иммунопреципитации хроматина и, вероятно, исследований хромогена иммунопреципитации.
Abstract
Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным методом определения связывания белка с ДНК хроматина. Однако богатая волокнами скелетная мышца была проблемой для ЧИП из-за технических трудностей в изоляции высококачественных ядер с минимальным загрязнением миофибрилл. Предыдущие протоколы пытались очистить ядра перед сшиванием, что сопряжено с риском изменения взаимодействия ДНК-белка во время процесса подготовки длительных ядер. В текущем протоколе мы сначала скрещивали скелетную мышечную ткань, собранную у мышей, и ткани измельчали и обрабатывали ультразвуком. Поскольку мы обнаружили, что ультрацентрифугирование не способно отделять ядра от миофибрилл, используя сшитую мышечную ткань, мы разработали последовательную процедуру фильтрации для получения высококачественных ядер, лишенных значительного миофибрильного загрязнения. Затем мы получали хроматин с помощью ультразвукового анализатора, а анализы ChIP с антителом против BMAL1 выявили устойчивое циркадное связываниеОбразец BMAL1 для целевых промоторов генов. Этот протокол фильтрации представляет собой легко применимый метод выделения высококачественных ядер из сшитой ткани скелетных мышц, что позволяет проводить последовательную обработку проб для суточных и других чувствительных к времени исследований. В сочетании с секвенированием следующего поколения (NGS) наш метод может быть развернут для различных механистических и геномных исследований с упором на функцию скелетных мышц.
Introduction
Скелетные мышцы играют важную роль в физиологии и поведении. Многонуклеированное мышечное волокно состоит из миофибрилл, где функциональные единицы актина и миозина образуют саркомеры для создания сократительной силы. Скелетные мышцы также являются крупнейшим метаболическим органом в организме, что составляет> 80% потребления постпрандиальной глюкозы на 80% и регулирует реакцию инсулина и метаболический гомеостаз 1 , 2 . Физиология мышц и метаболизм тесно регулируются циркадианными часами, внутренним биологическим таймером 3 , 4 , 5 , 6 . Например, скелетная мускулативная делеция Bmal1 , одного из основных циркадных компонентов часов, привела к резистентности к инсулину и уменьшению поглощения глюкозы в скелетных мышцах, и у животных, как было установлено, развился диабет 2 типа. яКроме того, скелетные мышцы также все чаще оцениваются как эндокринный орган 8 , выделяя миокины для регулирования системного метаболизма и физиологии. Механические исследования необходимы для полного понимания этих регуляторных функций в скелетных мышцах.
ChIP является мощным подходом к разграничению рекомбинации промоторов ДНК-связывающих белков. Первоначально ChIP был разработан для идентификации нуклеосомной организации на ДНК хроматина 9 , 10 . С тех пор сообщалось о различных методах сшивания белков и хроматиновой ДНК с использованием формальдегида, диметилсульфата или ультрафиолетового облучения (УФ) 11 , 12 . Формальдегидная сшивка является наиболее часто используемой, сохраняющей структуру хроматина и ДНК-белковыми взаимодействиями 9 , 13 , 14 . Сшитая хроматографияIn, измельчается ультразвуком и иммунопреципитируется антителом против специфического связывающего ДНК белка, представляющего интерес 15 , 16 . В последние годы было разработано ChIP-секвенирование (ChIP-seq), метод, объединяющий ChIP с NGS, для опроса связывания фактора транскрипции генома 17 , а в некоторых случаях для мониторинга динамических изменений за время 18 , 19 , 20 , Например, циркадные исследования ChIP-seq выявили высокоорганизованную последовательность геномного связывания циркадных часовых компонентов и гистоновых маркеров, которые приводят к временной точной экспрессии генов в течение 24-часового циркадного цикла 18 .
Большинство доступных протоколов ChIP предназначены для мягких тканей ( например, печени, головного мозга и т. Д. ), И очень немногие были опубликованы для твердых тканей, включая скелеМышцы. Технически сложно гомогенизировать богатую клетчаткой скелетную мышцу и изолировать высококачественные ядра 21 , особенно для экспериментов ChIP, которые требуют сшивания. В недавнем исследовании ChIP 22 мышц сателлитные клетки были отделены от миофибрилл, и ядра были получены из обоих типов клеток с помощью продолжительной процедуры, включающей переваривание тканей. Весь процесс занимает примерно три часа, чтобы завершить сшивку формальдегида на изолированных ядрах. В то время как в этой процедуре избегалось сшивание мышечного волокна, что делает мышечную ткань еще более огнестойкой для эффективной гомогенизации и способно производить высококачественные ядра, значительная временная задержка от сбора тканей до сшивания ядер приводит к риску изменения ДНК -протеинового взаимодействия. В отличие от этого, большинство исследований выполняли сшивание сразу после экспериментального лечения или сбора ткани, чтобы сохранить ДНК-протеины в реальном времениN привязка 12 . Второй недостаток изоляции ядер перед сшиванием состоит в том, что он исключает приложения, чувствительные к времени, такие как циркадный сбор проб, который обычно происходит с интервалами 3-4 ч. Без поперечной сшивки ядер изоляция должна протекать сразу же после вскрытия, тогда как сшитые образцы могут быть обработаны вместе по завершении всего времени, что обеспечивает большую экспериментальную согласованность.
Сообщалось также о других протоколах для изоляции ядер от несшитых скелетных мышц. В двух исследованиях описывалось использование градиентного ультрацентрифугирования для отделения ядер от оставшихся миофибрилл и клеточного мусора 23 , 24 . В то время как ультрацентрифугирование сахарозы или коллоидного градиента эффективно с несшитыми мышечными тканями, наши эксперименты показали, что после сшивания градиентное ультрацентрифугирование не позволяет отделить ядра от клетки dEbris на градиенте.
Поэтому мы разработали процедуру выделения высококачественных ядер с использованием сшитых мышечных тканей скелетных мышц. Вместо градиентного ультрацентрифугирования мы разработали метод последовательной фильтрации для эффективного отделения ядер от мусора. После ультразвукового исследования образцы хроматина были успешно применены для исследований ChIP, которые показали циркадную картину связывания белка BMAL1 с целевыми промоторами. Наш метод может быть широко применим для различных механистических исследований мышечных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем надежный метод, в котором сшитые скелетные мышечные ткани использовались для выделения высококачественных ядер. Была проведена последовательная фильтрация для эффективного отделения ядер от мусора, а ультразвуковая акустическая энергия от чашеобразного преобразова…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Карин Эссер, Нобуя Койке и Ноэхон-Парк за полезные советы. Эта работа была частично поддержана NIH / NIGMS (R01GM114424) для S.-HY, а Фонд Роберта А. Уэлша (AU-1731) и NIH / NIA (R01AG045828) – ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
Referências
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
