مضبوطات اليكتروكونفولسيفي في الفئران وتجزئة لهذه هيبوكامبي دراسة التغيرات المستحثة بالضبط في البروتينات بوستسينابتيك الكثافة
Summary
Electroconvulsive الاستيلاء (ECS) نموذج حيوانات تجريبية للعلاج اليكتروكونفولسيفي للاكتئاب الشديد. ECS عالمياً يحفز النشاط في قرن آمون، مما يؤدي إلى سينابتوجينيسيس واللدونه متشابك. وهنا يصف لنا طرق الاستقراء ECS في الفئران ووجود سوبسيلولار من هيبوكامبي بهم دراسة التغيرات المستحثة بالضبط في البروتينات متشابك.
Abstract
الاستيلاء على اليكتروكونفولسيفي (ECS) نموذج حيوانات تجريبية electroconvulsive العلاج، العلاج الأكثر فعالية للاكتئاب الشديد. ECS يستحث المعمم منشط رمعي المضبوطات مع انخفاض معدلات الوفيات، وموت الخلايا العصبية، وهو نموذج يستخدم على نطاق واسع للعقاقير المضادة للصرع الشاشة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الاستقراء ECS في الذي يتم تسليم الحالي 55-اماه موجزاً عن 0.5 الجرذان s للذكور 200-250 جم في الوزن عن طريق أقطاب مشبك الإذن. هذا التحفيز الثنائية أنتجت المرحلة 4-5 رمعي المضبوطات التي استغرقت حوالي 10 ثانية. بعد وقف ECS الحاد أو المزمن، شام معظم الفئران استعادت منشودا سلوكيا من الفئران “لا مصادرة”. لأنه يرفع ECS عالمياً نشاط الدماغ، كما استخدمت لدراسة التعديلات المعتمدة على نشاط البروتينات متشابك وآثارها على قوة متشابك باستخدام أساليب متعددة. على وجه الخصوص، يتيح تجزئة سوبسيلولار بوستسينابتيك كثافة (PSD) في تركيبة مع النشاف الغربية لتحديد كمي لوفرة البروتينات متشابك في هذا الهيكل متشابك المتخصصة. على النقيض من أسلوب تجزئة سابقة التي تتطلب كمية كبيرة من أدمغة القوارض، يصف لنا هنا أسلوب تجزئة صغيرة لعزل مديرية الأمن العام من هيبوكامبي من فأر واحد، دون السكروز التدرج الطرد المركزي. باستخدام هذا الأسلوب، نظهر أن الكسر PSD معزولة تحتوي على بروتينات الغشاء بوستسينابتيك، بما في ذلك PSD95، GluN2B، و GluA2. سينابتوفيسين ماركر presynaptic وقابل للذوبان بروتين هيولى α-tubulin استبعدت من الكسر مديرية الأمن العام، مما يدل على نجاح PSD العزلة. وعلاوة على ذلك، انخفض ECS المزمنة التعبير GluN2B في مديرية الأمن العام، مشيراً إلى أن لدينا أسلوب تجزئة PSD الصغيرة يمكن تطبيقها على الكشف عن التغييرات في البروتينات PSD هيبوكامبال من فأر واحد بعد العلاجات الجينية أو صيدلانية أو الميكانيكية .
Introduction
وقد استخدمت العلاج اليكتروكونفولسيفي لعلاج المرضى الذين يعانون من اضطرابات الاكتئاب الرئيسية، بما في ذلك الاكتئاب المقاوم للعقاقير والاكتئاب الثنائي القطب وأمراض باركنسون ومرض الفصام1،2. في هذا العلاج، وتولد الاستيلاء على التحفيز الكهربائي تسليمها إلى رئيس تخديره من المرضى عن طريق ابيكرانيال أقطاب1،،من23. وقد الإدارة المتكررة من ECS سريرياً مفيدة لاضطرابات الاكتئاب المقاوم للأدوية1،،من23. ومع ذلك، ظل الآلية الدقيقة الأساسية الطويلة الأجل فعالية تأثير الاكتئاب في البشر هدفا بعيد المنال. ECS هو نموذج حيوان للعلاج اليكتروكونفولسيفي، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في آليته العلاجية. في القوارض، ECS الحادة والمزمنة ECS العلاج تعزيز الخلايا الكبار في هيبوكامبي وإعادة تنظيم شبكات عصبونية4،5، التي من المرجح أن تساهم التحسينات في المرونة المعرفية. وعلاوة على ذلك، يغير الارتفاع العالمي لنشاط الدماغ ECS وفرة النصوص، مثل دماغ المستمدة عامل تم6، والبروتينات متعددة، بما في ذلك ميتابوتروبيك غلوتامات مستقبلات 17 و N-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) نوع غلوتامات مستقبلات مفارز7. وتشارك هذه التغييرات في وساطة طويلة الأجل التعديل رقم المشبك وهيكل وقوة في8،،من7الحصين9.
في نماذج ECS، يتم تسليم التحفيز الكهربائي للقوارض عن طريق أقطاب مزروع ستيريوتاكسيكالي أو أقطاب القرنية أقطاب الإذن لاستحضار المضبوطات منشط رمعي المعمم10،11. ستيريوتاكسيك غرس أقطاب ينطوي على جراحة الدماغ، ويتطلب قدرا كبيرا من الوقت لتحسين مهارات المجرب العمليات الجراحية للتقليل من الإصابة. يمكن أن يسبب كشط القرنية وجفاف أقطاب القرنية أقل الغازية وتتطلب التخدير. استخدام أقطاب الإذن-كليب يتجاوز هذه القيود لأنها يمكن استخدامه على القوارض دون الجراحة أو التخدير، وتتسبب في إصابة الحد الأدنى. وفي الواقع، وجدنا أن الفئران تم تسليمها إلى مستيقظا الحالية عن طريق أقطاب الإذن-كليب موثوق الحث على مضبوطات منشط رمعي المرحلة 4-5 ويغير البروتينات متشابك في هذه هيبوكامبي10.
دراسة وفرة المستحثة ECS البروتينات متشابك في مناطق محددة من الدماغ القوارض، من المهم أن تختار الأساليب التجريبية التي الأكثر ملاءمة للكشف والتحديد الكمي. وجود سوبسيلولار في الدماغ يسمح لعزل النفط الخام القابلة للذوبان البروتينات سيتوسوليك؛ بروتينات الغشاء؛ عضية-حدود البروتينات؛ وحتى البروتينات في هياكل سوبسيلولار الخاصة، مثل ال13،،من12مديرية الأمن العام14. مديرية الأمن العام هو مجال سوبسيلولار كثيفة ومنظمة تنظيماً جيدا في الخلايا العصبية التي بروتينات متشابك مركزة للغاية في وبالقرب من غشاء بوستسينابتيك12،،من1315. عزل مديرية الأمن العام مفيدة لدراسة البروتينات متشابك أثري في مديرية الأمن العام، منذ التغيرات الدينامية في وفرة ووظيفة مستقبلات الغلوتامات بوستسينابتيك والسقالات البروتينات والبروتينات في توصيل الإشارات في مديرية الأمن العام12 , 15 , 16 , 17 ترتبط اللدونة متشابك وسينابتوباثي لوحظت في العديد من الاضطرابات العصبية17،18. طريقة تجزئة سوبسيلولار سابقة تستخدم لتنقية مديرية الأمن العام تشارك عزلة الكسر تستعصي على الحل المنظفات من الكسر الخام غشاء المخ بالطرد المركزي التفاضلي السكروز التدرجات14، 19-ويتمثل التحدي الرئيسي بهذا الأسلوب التقليدي فإنه يتطلب كميات كبيرة من القوارض العقول14،19. إعداد القوارض 10-20 لعزل الكسر PSD كل معاملة يتطلب تكلفة كبيرة واستثمار الوقت وليست قابلة للتطبيق عمليا إذا كان هناك العديد من العلاجات.
للتغلب على هذا التحدي، ونحن قد تكيفت أسلوب أبسط مباشرة يعزل الكسر PSD، دون السكروز التدرج الطرد المركزي2120،، وتنقيحه لتكون قابلة للتطبيق لعزل مديرية الأمن العام من هيبوكامبي من فأر واحد الدماغ. لدينا أسلوب تجزئة PSD صغار غلة عن 30-50 ميكروغرام من البروتينات مديرية الأمن العام من هيبوكامبي 2، كافية لاستخدامها في عدة فحوصات الكيمياء الحيوية، بما في ذلك إيمونوبريسيبيتيشن وغرب النشاف. النشاف الغربية يوضح نجاح أسلوبنا لعزل مديرية الأمن العام بالكشف عن إثراء بوستسينابتيك كثافة البروتين 95 (مديرية الأمن العام-95) واستبعاد سينابتوفيسين ماركر presynaptic وقابل للذوبان بروتين هيولى α-توبولين. لدينا ECS التعريفي وطرق تجزئة PSD الصغيرة هي قابلة للتكيف بسهولة إلى مناطق أخرى في الدماغ القوارض وتوفر طريقة بسيطة نسبيا ويمكن الاعتماد عليها لتقييم آثار ECS على التعبير عن البروتينات مديرية الأمن العام.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب الاستقراء ECS في الفئران التي يتسبب تحفيز نشاط الخلايا العصبية في هذه هيبوكامبي العالمية. ECS هو نموذج حيوان العلاج اليكتروكونفولسيفي، الذي يستخدم سريرياً لعلاج المخدرات اضطرابات الاكتئاب المقاوم للحرارة في البشر1،،من23…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور إريك جيم بولتون للسماح لنا باستخدام أجهزة الطرد المركزي له لتجزئة والدكتور غراهام H. ديرينج في مختبر الدكتور ريتشارد لام هوجانير جامعة جون هوبكنز لتزويدنا بالبروتوكول الصغيرة لتجزئة مديرية الأمن العام.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
Referências
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
