Elektrochok anfald hos rotter og fraktionering af deres Hippocampi til at undersøge beslaglæggelse-inducerede ændringer i postsynaptiske tæthed proteiner
Summary
Elektrochok beslaglæggelse (ECS) er en eksperimenterende dyremodel af elektrochok behandling for svær depression. ECS stimulerer globalt aktivitet i hippocampus, fører til synaptogenesis og synaptisk plasticitet. Her, beskriver vi metoder for ECS induktion i rotter og subcellulært fraktionering af deres hippocampi til at undersøge beslaglæggelse-inducerede ændringer i synaptic proteiner.
Abstract
Elektrochok beslaglæggelse (ECS) er en eksperimenterende dyremodel af elektrochok terapi, den mest effektive behandling for svær depression. ECS inducerer generaliseret tonisk-kloniske anfald med lav dødelighed og neuronal død og er en meget anvendt model til skærmen anti-epileptisk medicin. Her, vi beskriver en ECS induktion metode i som en kort 55-mA strøm er leveret til 0,5 s hen til Handyr rats 200-250 g i vægt via øret-klip elektroder. Sådanne bilaterale stimulation produceret etape 4-5 kloniske anfald, der varede cirka 10 s. Efter ophør af akut eller kronisk ECS, de fleste rotter kommet for at blive behaviorally skelnes fra humbug “ingen beslaglæggelse” rotter. Fordi ECS hæver globalt hjerneaktivitet, er det også blevet brugt til at undersøge aktivitet-afhængige ændringer af synaptic proteiner og deres effekter på synaptisk styrke ved hjælp af flere metoder. Især subcellulært fraktionering af postsynaptiske massefylde (PSD) i kombination med Western blotting giver mulighed for kvantitativ bestemmelse af overfloden af synaptic proteiner på denne specialiserede synaptic struktur. I modsætning til en tidligere fraktionering metode, der kræver store mængder af gnaver hjerner, beskriver vi her en mindre fraktionering metode til at isolere PSD fra hippocampi af en enkelt rotte, uden saccharose gradient centrifugering. Ved hjælp af denne metode, viser vi, at den isolerede PSD fraktion indeholder postsynaptiske Membranproteiner, herunder PSD95, GluN2B og GluA2. Præsynaptiske markør synaptophysin og opløselige cytoplasmatiske protein α-tubulin blev udelukket fra PSD brøkdel, demonstrerer vellykket PSD isolation. Derudover faldt kronisk ECS GluN2B udtryk i PSD, der angiver, at vores små PSD fraktionering metode kan anvendes til at registrere ændringerne i hippocampus PSD proteiner fra en enkelt rotte efter genetiske, farmakologiske eller mekaniske behandlinger .
Introduction
Elektrochok terapi har været anvendt til behandling af patienter med større depressive lidelser, herunder svær resistent depression, bipolar depression, Parkinsons sygdomme, og skizofreni1,2. I denne behandling genereres beslaglæggelse af elektriske stimulus leveret til lederen af bedøvede patienter via epicranial elektroder1,2,3. Gentagen administration af ECS har været klinisk gavnlig medicinresistente depressive lidelser1,2,3. Imidlertid har den nøjagtige mekanisme bag den langsigtede effekt af antidepressiv effekt hos mennesker forblev undvigende. ECS er en dyremodel af elektrochok terapi og er almindeligt anvendt til at undersøge sin terapeutiske mekanisme. I gnavere, både akut ECS og kronisk ECS behandling fremme voksen neurogenese i hippocampi og omstrukturere de neurale netværk4,5, som forventes at bidrage til forbedringer i kognitiv fleksibilitet. Derudover ændrer globale udvidelse af hjerneaktivitet af ECS overfloden af udskrifter, såsom en hjerne afledt neurotropic faktor6, og flere proteiner, herunder metabotropic glutamat receptor 17 og N-methyl-D-aspartat (NMDA) type glutamat receptor underenheder7. Disse ændringer er involveret i mægler langsigtet ændring af synapse nummer, struktur og styrke i hippocampus7,8,9.
I ECS modeller, er elektrisk stimulation leveret til gnavere via stereotaxically implanterede elektroder, cornea elektroder eller øre elektroder til at fremmane generaliseret tonisk-kloniske anfald10,11. Stereotaxisk implantation af elektroder indebærer hjernekirurgi og kræver en væsentlig tid til at forbedre den eksperimentatoren kirurgiske færdigheder for at minimere skaden. Mindre invasive hornhinde elektroder kan forårsage hornhinde slid og tørhed og kræver bedøvelse. Brugen af øre-klip elektroder omgår disse begrænsninger, fordi de kan bruges på gnavere uden operation eller anæstesi og minimal skade. Faktisk, vi fandt, at nuværende leveres til vågen rotter via øret-klip elektroder pålideligt inducerer fase 4-5 tonisk-kloniske anfald og ændrer synaptic proteiner i deres hippocampi10.
For at undersøge den ECS-induceret overflod af synaptic proteiner i de specifikke hjerneregioner af gnavere, er det vigtigt at vælge de eksperimentelle metoder, der er mest egnet til deres påvisning og kvantificering. Subcellulært fraktionering af hjernen giver mulighed for den rå isolation af opløselige cytosole proteiner; Membranproteiner; organelle-grænser proteiner; og selv proteiner i særlige subcellulært strukturer, såsom PSD12,13,14. PSD er en tæt og velorganiseret subcellulært domæne i neuroner, synaptic proteiner er meget koncentreret på og i nærheden af postsynaptiske membran12,13,15. Isolering af PSD er nyttig for studiet af synaptic proteiner beriget på PSD, da dynamiske ændringer i overflod og funktion af postsynaptiske glutamat receptorer, stilladser proteiner og signaltransduktion proteiner i PSD12 , 15 , 16 , 17 er korreleret med synaptisk plasticitet og synaptopathy observeret i flere neurologiske17,18. En tidligere subcellulært fraktionering metode bruges til at rense PSD involveret isolation af de detergent-uopløselige fraktion fra rå membran brøkdel af hjernen ved den differentierede centrifugering af saccharose forløb14, 19. den store udfordring med denne traditionelle metode er, at det kræver store mængder af gnaver brains14,19. Forberedelse af 10-20 gnavere at isolere PSD brøkdel pr. behandling kræver omfattende omkostninger og tid investeringer og er ikke praktisk muligt, hvis der er mange behandlinger.
For at overvinde denne udfordring, har vi tilpasset en enklere metode, der direkte isolerer PSD fraktion, uden saccharose gradient centrifugering20,21, og revideret den for at være gældende for PSD isolation fra hippocampi af en enkelt rotte hjernen. Vores små PSD fraktionering metode giver om 30-50 µg af PSD proteiner fra 2 hippocampi, tilstrækkelige til brug i flere biokemiske analyser, herunder immunoprecipitation og Western blotting. Western blotting viser succesen med vores metode til at isolere PSD ved at afsløre berigelse af postsynaptiske tæthed protein 95 (PSD-95) og udelukkelse af præsynaptiske markør synaptophysin og opløselige cytoplasmatiske protein α-tubulin. Vores ECS induktion og små PSD fraktionering metoder er let at tilpasse til andre gnavere hjerneregioner og giver en relativt enkel og pålidelig måde at evaluere virkningerne af ECS på udtryk for PSD proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en ECS induktion metode i rotter, der fremkalder den globale stimulation af neuronal aktivitet i deres hippocampi. ECS er en dyremodel af elektrochok terapi, som er klinisk anvendes til behandling af narkotika ildfaste depressive lidelser i mennesker1,2,3. Trods brugen af elektrochok terapi til behandling af svær depression, den præcise underliggende mekanisme er fortsat uklart. Fordi ECS inducerer depressant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Dr. Eric C. Bolton for at lade os bruge sin centrifuge til fraktionering og Dr. Graham H. Diering i Dr. Richard L. Huganir lab på John’s Hopkins University for at give os med de små protokol for PSD fraktionering.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
Referências
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
