Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine
Summary
Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l’attività nell’ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.
Abstract
Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello animale sperimentale di terapia elettroconvulsiva, il trattamento più efficace per la depressione grave. ECS induce i grippaggi tonico-clonic generalizzati con bassa mortalità e morte neuronale ed è un modello ampiamente usato ai farmaci antiepilettici schermo. Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS nel quale viene erogata una corrente di 55-mA breve per 0,5 s per uomo ratto 200-250 g di peso tramite elettrodi clip orecchio. Tale stimolazione bilaterale prodotto fase cloniche 4-5 che è durato circa 10 s. Dopo la cessazione dell’ECS acuta o cronica, maggior parte dei ratti ha recuperati per essere relativamente al comportamento indistinguibile da sham ratti “nessuna crisi”. Perché ECS eleva a livello globale l’attività cerebrale, è stato utilizzato anche per esaminare le alterazioni di attività-dipendente di proteine sinaptiche e loro effetti sulla forza sinaptica utilizzando più metodi. In particolare, frazionamento subcellulare della densità post-sinaptica (PSD) in combinazione con Western blotting consente la determinazione quantitativa dell’abbondanza di proteine sinaptiche presso questa struttura sinaptica specializzata. In contrasto con un precedente metodo di frazionamento che richiede grandi quantità di cervello del roditore, descriviamo qui un metodo di frazionamento su piccola scala per isolare il PSD da ippocampi di un singolo ratto, senza centrifugazione in gradiente di saccarosio. Utilizzando questo metodo, mostriamo che le frazioni isolate di PSD contiene proteine di membrana postsinaptica, tra cui PSD95, GluN2B e GluA2. Presinaptici marcatore synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina sono stati esclusi dalla frazione PSD, dimostrando il successo isolamento PSD. Inoltre, ECS cronica diminuita espressione di GluN2B in PSD, che indica che il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala può essere applicata per rilevare i cambiamenti nelle proteine PSD hippocampal da una singolo ratto dopo trattamenti genetici, farmacologici o meccanici .
Introduction
Terapia di Electroconvulsive è stata utilizzata per trattare pazienti con disturbi depressivi maggiori, tra cui grave depressione farmaco-resistenti, depressione bipolare, malattie di Parkinson e schizofrenia1,2. In questa terapia, il sequestro viene generato da stimolo elettrico consegnato alla testa dei pazienti anestetizzati via epicranica elettrodi1,2,3. Ripetitivo di ECS è stato clinicamente utile per i disturbi depressivi resistenti alla droga1,2,3. Tuttavia, l’esatto meccanismo alla base dell’efficacia a lungo termine dell’effetto antidepressivo in esseri umani è rimanere evasivo. ECS è un modello animale della terapia electroconvulsive ed è ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo terapeutico. Nei roditori, ECS acuta sia cronico trattamento ECS promuovere neurogenesi adulta negli ippocampi e riorganizzare la rete neurale4,5, che rischia di contribuire al miglioramento della flessibilità cognitiva. Inoltre, global elevazione dell’attività cerebrale di ECS altera l’abbondanza delle trascrizioni, come un cervello derivato fattore neurotropo6e più proteine, tra cui metabotropici del glutammato recettore 17 e la N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutammato recettore subunità7. Questi cambiamenti sono coinvolte nel mediare la modifica a lungo termine del numero di sinapsi, la struttura e la forza in ippocampo7,8,9.
Nei modelli ECS, stimolazione elettrica viene consegnata ai roditori tramite elettrodi impiantati stereotassicamente, elettrodi corneali o elettrodi auricolari per evocare i grippaggi tonico-clonic generalizzati10,11. Stereotassica impianto di elettrodi comporta un’operazione al cervello e richiede tempi significativi per migliorare le abilità chirurgica dello sperimentatore per minimizzare il danno. Meno invasivi elettrodi corneali potrebbero causare secchezza e abrasione corneale e richiede anestesia. L’uso di elettrodi clip orecchio ignora queste limitazioni perché può essere utilizzati su roditori senza chirurgia o anestesia e causare lesioni minime. Infatti, abbiamo trovato che corrente consegnati a sveglio ratti tramite clip orecchio elettrodi attendibilmente induce grippaggi tonico-clonic fase 4-5 e altera le proteine sinaptiche nel loro ippocampi10.
Per esaminare l’ECS indotte abbondanza di proteine sinaptiche nelle regioni specifiche del cervello dei roditori, è importante scegliere i metodi sperimentali che sono più adatti per la loro rilevazione e quantificazione. Frazionamento subcellulare del cervello consente l’isolamento grezza delle proteine citosoliche solubili; proteine di membrana; proteine dell’organello-limiti; e anche proteine in speciali strutture subcellulari, come ad esempio le PSD12,13,14. Il PSD è un dominio subcellulare denso e ben organizzato in neuroni in cui proteine sinaptiche sono altamente concentrati e vicino la membrana postsinaptica12,13,15. L’isolamento del PSD è utile per lo studio di proteine sinaptiche, arricchito il PSD, dal cambiamenti dinamici nell’abbondanza e nella funzione dei recettori postsinaptici del glutammato, ponteggi proteine e proteine di transduction del segnale nel PSD12 , 15 , 16 , 17 sono correlati con plasticità sinaptica e la synaptopathy osservata in diversi disturbi neurologici17,18. Un precedente metodo di frazionamento subcellulare utilizzato per purificare il PSD ha coinvolto l’isolamento della frazione detersivo-insolubili dalla frazione grezza della membrana del cervello tramite la centrifugazione differenziale di saccarosio gradienti14, 19. la grande sfida con questo metodo tradizionale è che richiede grandi quantità di roditore cervelli14,19. Preparazione dei roditori di 10-20 per isolare la frazione PSD per ogni trattamento richiede costi vasto e investimento di tempo e non è praticamente fattibile se ci sono molti trattamenti.
Per superare questa sfida, abbiamo adattato un metodo più semplice che direttamente consente di isolare la frazione PSD, senza saccarosio mediante centrifugazione in gradiente20,21e rivisto per essere applicabile all’isolamento PSD da ippocampi di un singolo ratto cervello. Il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala produce circa 30-50 µ g di proteine PSD da 2 ippocampi, sufficiente per l’impiego in diversi saggi biochimici, tra cui immunoprecipitazione e Western blotting. Macchiarsi occidentale dimostra il successo del nostro metodo per isolare il PSD rivelando l’arricchimento della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e l’esclusione di marcatore presinaptici synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina. Nostra induzione ECS e metodi di frazionamento PSD su piccola scala sono facilmente adattabili ad altre regioni del cervello del roditore e consentono di valutare gli effetti di ECS sull’espressione di proteine PSD in modo relativamente semplice e affidabile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS in ratti che suscita la stimolazione globale dell’attività neuronale in loro ippocampi. ECS è un modello animale di elettroshockterapia, che è clinicamente utilizzato per trattare disturbi depressivi refrattario droga in esseri umani1,2,3. Nonostante l’uso della terapia di electroconvulsive per trattare la depressione severa, il preciso meccanismo di fondo rimane poco chiaro. Perch?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Eric C. Bolton per averci permesso di utilizzare la centrifuga per frazionamento e Dr. Graham H. Diering nel laboratorio del Dr. Richard L. Huganir di John Hopkins University per averci fornito il protocollo su piccola scala per il frazionamento di PSD.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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