電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで
Summary
電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.
Abstract
電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病の最も効果的な治療、電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS は低い死亡率と神経細胞死全般強直間代けいれん発作を誘発して画面抗てんかん薬に広く使われているモデルです。ここでは、ECS 誘導法について述べる短い 55 mA の電流が 0.5 に渡されるかどれで男性に s ラット耳クリップ電極を介して重量で 200-250 g。このような二国間の刺激生成期続いた約 10 4 5 間代発作 s。急性または慢性の ECS の中止後、ほとんどのラットの行動と区別する回復偽「発作がない「ラットの。ECS は、世界的に脳の活動を高めます、活動依存的シナプス蛋白質と複数のメソッドを用いたシナプス強度への影響の変化を確認するそれ使用されてもいます。特に、西部のしみとの組み合わせでシナプス後密度 (PSD) の細胞レベル下の分別のこの特殊なシナプス構造体でシナプス蛋白質の豊富な定量可能します。齧歯動物の頭脳の大規模な量を必要とする従来の分別方法と対照をなして我々 はショ糖勾配遠心法なし、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するための小規模な画法をここで説明します。このメソッドを使用して、分離された PSD 割合にシナプス後膜蛋白質、PSD95、GluN2B、GluA2 などが含まれていることを紹介します。シナプス マーカー シナプトフィジンと可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンが成功した psd ファイルの分離を示す PSD 分数から除外しました。さらに、慢性的な ECS 減少単一のラットからの海馬の PSD タンパク質の遺伝的、薬理学的、または機械的治療後変更を検出する小規模 PSD 分別手法を適用できることを示す、PSD の GluN2B 式.
Introduction
電気けいれん療法は、重度の薬剤抵抗性うつ病、双極性うつ病、パーキンソン病、統合失調症1,2を含む、大鬱病性障害患者を治療するために使用されています。この療法は、帽状電極1,2,3経由で麻酔をかけられた患者の頭に配信電気刺激による発作が生成されます。ECS の反復的な管理は、薬剤抵抗性うつ病1,2,3に臨床的に有益されています。しかし、ヒトの抗うつ効果の長期的効果の正確なメカニズムは、とらえどころのない推移しています。ECS は、電気けいれん療法の動物モデルで、その治療メカニズムを調査する使用は広く。齧歯類で、なったで成体神経新生を促進する ECS 急性と慢性の ECS 治療と再編成ニューラル ネットワーク4、5、認知の柔軟性に寄与する可能性があります。さらに、ECS による脳活動のグローバルな昇格、転写の豊富さを変更脳由来神経向性因子6、および代謝型グルタミン酸受容体 17 N メチル D アスパラギンなど複数のタンパク質など(NMDA) 型グルタミン酸受容体サブユニット7。これらの変更は、シナプス結合の数、構造、および海馬7,8,9の強度の長期的な修正を媒介に関与しています。
ECS のモデルで電気刺激がてんかん注入電極、角膜電極または耳電極を介して全般強直間代けいれん発作10,11を換起する齧歯動物に配信されます。脳定位固定装置注入電極の脳外科手術では、実験者の損傷を最小限に抑える手術技能を改善するために膨大な時間を必要とします。少ない侵襲角膜電極や麻酔を必要とする角膜上皮剥離や乾燥原因になります。耳クリップ電極の使用は、手術や麻酔なしの齧歯動物で使用できる最小限の損傷の原因となるために、これらの制限をバイパスします。確かに、耳クリップ電極を介して現在に目を覚まし配信ラットは確実にステージ 4 5 強直間代発作を誘発してなった10代でシナプス蛋白質の変化がわかった。
齧歯動物の脳の特定領域におけるシナプス蛋白質の ECS による豊かさを調べると、その検出と定量に最も適している実験方法を選択することが重要です。脳の細胞レベル下の分別は、水溶性ゾル性細胞質蛋白質の粗分離膜蛋白質;オルガネラ範囲蛋白質;そして PSD12,13,14など、特別な細胞レベル下の構造の蛋白質。PSD は、ニューロンのシナプス蛋白質は、シナプス後膜12,13,15に近い高濃度で整然と密な細胞内ドメインです。PSD の分離は豊かさとシナプス グルタミン酸受容体、足場蛋白質および PSD12のシグナル伝達タンパク質の機能のダイナミックな変化から、PSD で濃縮シナプス蛋白質の研究に有用,15,16,17は、シナプス可塑性といくつかの神経疾患17,18, synaptopathy に関連付けられます。PSD を浄化するために使用される従来の細胞レベル下の分別のショ糖勾配14,差動遠心分離によって脳の粗膜画分から洗剤不溶性分画の分離に関与19. この従来の方法での大きな課題は大量の齧歯動物の脳1914,が必要です。10-20 の齧歯動物の治療あたり PSD 画分を分離するための準備は広範なコストと時間の投資が必要です、多くの治療法がある場合、実質的に不可能です。
このような課題を克服するために、我々 は直接 PSD 画分のショ糖勾配遠心法20,21, なしを分離し、単一のラットのなったから psd ファイルを分離するために適用できるようにそれを修正するより簡単な方法を適応しています。脳。私たち小規模 PSD 画法結果約 2 なった、免疫沈降とウェスタンブロットなどを含むいくつかの生化学的な試金で使用するために十分なから PSD タンパク質の 30-50 μ g。西部にしみが付くことシナプス後密度タンパク質 95 (PSD-95) の濃縮とシナプス マーカー シナプトフィジンおよび可溶性細胞質タンパク質 α-チューブリンの除外を明らかにして psd ファイルを分離する方法の成功例を示します。私たち ECS の誘導と小規模の PSD の分別方法は他の齧歯動物の頭脳領域に容易に適応、ECS の PSD タンパク質の発現に及ぼす影響を評価するための比較的シンプルで信頼性の高い方法を提供します。
Protocol
動物科目を含むすべての実験手順は、機関の動物は気とイリノイ大学アーバナ ・ シャンペーン校で利用委員会によって承認されています。 1. ラット コロニーの維持 ラット (材料の表を参照) を繁殖し、12 時間の明暗サイクルとアドリブへの食料と水の標準的な条件でそれらを維持します。 (P) 28 生後日ラットの子犬を引き離すし、2-4 の男性?…
Representative Results
ここで説明されて詳細な手順を使用して 1 つの電気ショック (55 mA、100 パルス/秒 0.5 s) ラット (図 1A B) 4-5 強直間代発作へ耳クリップ電極による臨時ステージを届け。ラットの合計 8 は急性の ECS 誘導を受け、ステージ 4-5 強直間代発作を表示しました。発作が続いた約 10 s、およびすべてのラットが発作停止の 1-2 分以内に回復します…
Discussion
ここでは、ラットになったニューロン活動のグローバルな刺激を引き出す ECS 誘導法について述べる。ECS 人間1,2,3薬物難治性うつ病の治療に臨床的に使用される電気けいれん療法の動物モデルであります。重度のうつ病の治療に電気けいれん療法の使用にもかかわらず、正確なメカニズムは不明します。ECS の齧歯動物の反…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は博士エリック C. ボルトンをありがとう PSD 分別のため小規模のプロトコルと私たちを提供するためのジョンズ ・ ホプキンス大学で博士リチャード ・ l. Huganir の研究室での分別および博士グラハム H. Diering 彼の遠心分離機を使用することが可能します。
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
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Citar este artigo
Jang, S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).