Electroconvulsive beslag i rotter og fraksjoneres av deres Hippocampi for å undersøke anfall-induserte endringer i Postsynaptic tetthet proteiner
Summary
Electroconvulsive beslag (ECS) er en eksperimentell dyr Elektrosjokkterapi for alvorlig depresjon. ECS stimulerer globalt aktivitet i hippocampus, fører til synaptogenesis og synaptiske plastisitet. Her beskriver vi metoder for ECS induksjon i rotter og subcellular fraksjoneres av deres hippocampi å undersøke anfall-induserte endringer i synaptic proteiner.
Abstract
Electroconvulsive beslag (ECS) er en eksperimentell dyr Elektrosjokkterapi, den mest effektive behandlingen for alvorlig depresjon. ECS induserer generalisert tonisk-kloniske anfall med lav dødelighet og neuronal død og en brukte modell til skjermen anti-epileptisk narkotika. Her beskriver vi en ECS induksjon metode i som en kort 55-mA gjeldende leveres for 0,5 å mannlig rotter 200-250 g i vekt øret elektroder. Slike bilaterale stimulering produserte stage 4-5 kloniske anfall som varte ca 10 s. Etter opphør av akutt eller kronisk ECS, høyst rotter gjenopprettet skal behaviorally utvisket fra humbug “ingen anfall” rotter. Fordi ECS løfter globalt hjerneaktivitet, er det også brukt undersøke aktivitet-avhengige endringer av synaptic proteiner og deres effekter på synaptiske styrke med flere metoder. Spesielt gir subcellular fraksjoneres av postsynaptic tetthet (PSD) i kombinasjon med vestlige blotting kvantitative fastsettelse av overflod av synaptic proteiner på dette spesialiserte synaptic struktur. I motsetning til en tidligere fraksjoneres metode som krever store mengder gnager hjerner, beskriver vi her en småskala fraksjoneres metode for å isolere PSD fra hippocampi i en enkelt rotte, uten sukrose gradient sentrifugering. På denne måten, viser vi at isolert PSD brøken inneholder postsynaptic membran proteiner, inkludert PSD95, GluN2B og GluA2. Presynaptic markør synaptophysin og løselig cytoplasmatiske protein α-tubulin ble utelatt fra PSD brøkdel, demonstrere vellykkede PSD isolasjon. Videre redusert kronisk ECS GluN2B uttrykk i PSD, indikerer at våre småskala PSD fraksjoneres metoden kan brukes for å oppdage endringer i hippocampus PSD proteiner fra rotte enkelt etter genetisk, farmakologiske eller mekanisk behandlinger .
Introduction
Elektrosjokkterapi er brukt til å behandle pasienter med store depressive lidelser, som alvorlig stoff-resistent depresjon, bipolar depresjon, Parkinsons sykdommer og schizofreni1,2. I denne terapi genereres anfall elektrisk stimulans levert til leder av bedøvet pasienter via epicranial elektroder1,2,3. Repeterende administrasjon av ECS har vært klinisk nyttig stoff-resistent depressive lidelser1,2,3. Men har den eksakte mekanismen underliggende langsiktige effekten av antidepressiva effekt hos mennesker vært unnvikende. ECS er en dyr modell av Elektrosjokkterapi og er mye brukt til å undersøke dens terapeutiske mekanikk. I Red, både akutt ECS og kronisk ECS behandling fremme voksen neurogenesis i hippocampi og omorganisere nettverk4,5, som er sannsynlig å bidra til forbedringer i kognitiv fleksibilitet. Videre endrer globale heving av hjerneaktivitet av ECS overflod av transkripsjoner, slik som en hjerne avledet neurotropic faktor6, og flere proteiner, inkludert metabotropic glutamat reseptor 17 og N-methyl-D-aspartate (NMDA) type glutamat reseptor underenheter7. Disse endringene er involvert i formidling langsiktige endring av synapse tall, struktur og styrke i hippocampus8,9–7,.
I ECS modeller leveres elektrisk stimulering for gnagere via stereotaxically implanterte elektroder, hornhinnen elektrodene eller øret elektroder å fremkalle generalisert tonisk-kloniske anfall10,11. Stereotaxic implantering av elektroder innebærer hjernekirurgi og krever betydelig tid til å forbedre den eksperimentator kirurgiske ferdigheter for å minimere skade. Mindre invasiv hornhinnen elektrodene kan forårsake hornhinnen avsliting og tørrhet, og krever narkose. Bruk av øret elektroder går utenom disse begrensningene, fordi de kan brukes på gnagere uten kirurgi eller anestesi og minimal skade. Faktisk fant vi at gjeldende leveres til våken rotter via øret elektroder pålitelig induserer scenen 4-5 tonisk-kloniske anfall og endrer synaptic proteiner i sine hippocampi10.
For å undersøke ECS-indusert overflod av synaptic proteiner i bestemte hjernen regioner i gnagere, er det viktig å velge de eksperimentelle metodene som passer for deres oppdagelse og kvantifisering. Subcellular fraksjoneres av hjernen gjør for råolje isolering av løselig cytosolic proteiner; membran proteiner; organeller-grensene proteiner; og selv proteiner i spesielle subcellular strukturer, for eksempel PSD12,13,14. PSD er et tett og velorganisert subcellular domene i nerveceller som synaptic proteiner er svært konsentrert i og nær postsynaptic membran12,13,15. Isolasjon av PSD er nyttig for studiet av synaptic proteiner beriket på PSD, siden dynamiske endringer i overflod og postsynaptic glutamat reseptorer, stillas proteiner og signal signaltransduksjon proteiner i PSD-12 , 15 , 16 , 17 er korrelert med synaptiske plastisitet og synaptopathy i flere nevrologiske lidelser17,18. En tidligere subcellular fraksjoneres metode brukt til å rense PSD involvert isolering av vaskemiddel-uløselig brøken fra råolje membran brøkdel av hjernen av differensial sentrifugering sukrose graderinger14, 19. den store utfordringen med denne tradisjonelle metoden er at det krever store mengder gnager hjerner14,19. Utarbeidelse av 10-20 gnagere isolere PSD brøken per behandling krever omfattende kostnader og tid investeringen og er ikke praktisk mulig hvis det er mange behandlinger.
For å overvinne denne utfordringen, har vi tilpasset en enklere metode som direkte isolerer PSD brøk, uten sukrose gradient sentrifugering20,21, og revidert gjelder til PSD isolasjon fra hippocampi av en enkelt rotte hjernen. Vår lille PSD fraksjoneres metoden gir om 30-50 µg av PSD proteiner fra 2 hippocampi, tilstrekkelig for bruk i flere biokjemiske analyser, inkludert immunoprecipitation og vestlige blotting. Vestlige blotting viser suksessen til vår metode for å isolere PSD av avslørende anriking av postsynaptic tetthet protein 95 (PSD-95) og utelukkelsen av presynaptic markør synaptophysin og løselig cytoplasmatiske protein α-tubulin. Vår ECS induksjon og småskala PSD fraksjoneres metoder kan lett tilpasses andre gnager hjernen regioner og en relativt enkel og pålitelig måte å evaluere effekten av ECS på uttrykk for PSD proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en ECS induksjon metode i rotter som utløser globale stimulering av neuronal aktivitet i deres hippocampi. ECS er en dyr Elektrosjokkterapi, som klinisk brukes til å behandle narkotika ildfaste depressive lidelser i mennesker1,2,3. Til tross for bruk av Elektrosjokkterapi å behandle alvorlig depresjon, den nøyaktige underliggende mekanismen er fortsatt uklart. Fordi ECS induserer depressant-lignende virkemå…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Eric C. Bolton for å la oss bruke hans sentrifuge for fraksjoneres og Dr. Graham H. Diering i Dr. Richard L. Huganir’s lab ved John Hopkins University for å gi oss med småskala protokollen PSD-fraksjoneres.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
Referências
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
