Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için
Summary
Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi, şiddetli depresyon için en etkili tedavi deneysel hayvan bir modeldir. ECS düşük mortalite ve nöronal ölüm ile jeneralize Tonik klonik nöbetler neden olmaktadır ve ekran anti-epileptik ilaçlar için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada, bir ECS indüksiyon yöntemi açıklamak hangi kısa bir 55-mA akım 0,5 için teslim edilir içinde s erkek için 200-250 g ağırlığında kulak-küçük elektrotlar aracılığıyla sıçanlar. Üretilen bu tür ikili stimülasyon sahne yaklaşık 10 süren 4-5 klonik nöbetler s. Akut veya kronik ECS bırakma sonra en rats davranışsal ayırt olmak kurtarıldı “nöbet” fareler sham. ECS genel olarak beyin aktivitesini yükseltir çünkü da faaliyet bağlı değişiklikler sinaptik proteinlerin ve sinaptik gücü birden çok yöntem kullanarak üzerindeki etkileri incelemek için kullanılmıştır. Özellikle, bu özel sinaptik yapısı, sinaptik proteinlerin bereket kantitatif tayin postsinaptik yoğunluğu (PSD), Western Blot birlikte hücre altı ayırma sağlar. Kemirgen beyin büyük miktarda gerektiren bir önceki ayırma yöntemi aksine, biz burada Sükroz degrade Santrifüjü olmadan tek bir sıçan hippocampi dan PSD yalıtmak için küçük ölçekli ayırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, biz izole PSD kesir postsinaptik membran proteinlerinin, PSD95, GluN2B ve GluA2 de dahil olmak üzere içerir gösterir. Presynaptic işaretçisi synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin başarılı PSD yalıtım gösteren PSD kesir dışlandı. Ayrıca, kronik ECS GluN2B ifade bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi genetik, farmakolojik veya mekanik tedaviler sonra Hipokampal PSD proteinler tek bir sıçan gelen değişiklikleri algılamak için uygulanabilir olduğunu belirten PSD olarak azalmıştır .
Introduction
Elektrokonvulsif terapi ağır ilaca dirençli depresyon, bipolar depresyon, Parkinson hastalıkları ve şizofreni1,2de dahil olmak üzere büyük depresif bozuklukların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu terapi, nöbet elektrik uyarıcı epicranial elektrotlar1,2,3üzerinden imzalat hastalar başkanı teslim tarafından oluşturulur. ECS tekrarlayan yönetimini ilaca dirençli depresif bozukluklar1,2,3‘ e klinik olarak yararlı olmuştur. Ancak, uzun vadede etkinlik insanlarda antidepresan etkisi altında yatan kesin mekanizması zor kalmıştır. ECS Elektrokonvulsif terapi hayvan bir modeldir ve tedavi onun mekanizma araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Rodents, akut ECS ve kronik ECS tedavi hippocampi yetişkin neurogenesis teşvik ve hangi bilişsel esneklik ilerleme-e doğru katkıda bulunmak olasıdır neural ağ4,5, yeniden düzenleyebilirsiniz. Ayrıca, beyin aktivitesi ECS tarafından küresel yükselmesine Tutanaklar, bolluk değiştirir gibi bir beyin neurotropic faktörü6ve metabotropic Glutamat reseptör 17 ve N-metil-D-aspartat dahil olmak üzere birden fazla protein elde (NMDA) tipi Glutamat reseptör alt birimleri7. Bu değişiklikler synapse numarası, yapısı ve Hipokampus7,8,9gücü uzun vadeli modifikasyonu arabuluculuk katılmaktadırlar.
ECS modellerinde, elektriksel stimülasyon jeneralize Tonik klonik nöbetler10,11uyandırmak için Stereotaxic implante elektrotlar, kornea elektrotlar veya kulak elektrotlar yoluyla kemirgenler teslim edilir. Elektrot stereotaksik implantasyon beyin ameliyatı içerir ve deneyci’nın yaralanma en aza indirmek için cerrahi becerilerini geliştirmek için önemli ölçüde zaman gerektirir. Daha az invaziv kornea elektrotlar kornea aşınma ve kuruluk neden olabilir ve anestezi gerektirir. Çünkü onlar kemirgen cerrahi ve anestezi olmadan kullanılabilir ve en az yaralanmalara neden kulak-küçük elektrotlar kullanımı bu sınırlamalar atlar. Gerçekten de, geçerli uyanık teslim fareler ile kulak-küçük elektrotlar güvenilir sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler neden olmaktadır ve onların hippocampi10sinaptik proteinler değiştirir bulduk.
Kemirgenler belirli beyin bölgelerinde sinaptik proteinlerin ECS kaynaklı bereket incelemek için kendi algılama ve miktar için en uygun deneysel yöntemleri seçmek önemlidir. Beyin hücre altı ayırma çözünür sitozolik protein ham yalıtımı için sağlar; zar proteinleri; Organel sınırları proteinler; ve proteinler PSD12,13,14gibi özel hücre altı yapıları arasında bile. PSD bir yoğun ve iyi organize edilmiş hücre altı sinaptik proteinler ve postsinaptik membran12,13,15yakınındaki yüksek konsantrasyonlu nöronlar malıdır. Yalıtım PSD PSD bereket ve postsinaptik Glutamat reseptörlerinin, iskele proteinler ve sinyal iletim proteinler PSD12 fonksiyon dinamik değişiklikleri beri zenginleştirilmiş sinaptik proteinlerin çalışma için yararlıdır , 15 , 16 , 17 sinaptik plastisite ve çeşitli nörolojik bozukluklar17,18içinde gözlenen synaptopathy ile ilişkili mısınız. Önceki hücre altı ayırma yöntemi PSD arındırmak için kullanılır beyin ham membran kısmını dan deterjan çözünmez kesir yalıtım tarafından Sükroz degradeler14, aralıklarla fark dahil. 19. o kemirgen büyük miktarlarda beyin14,19istemek bu geleneksel yöntemle büyük sorun olduğunu. PSD kesir tedavi başına izole etmek için 10-20 kemirgenler hazırlanması geniş maliyet ve zaman yatırım gerektirir ve birçok tedavi ise pratik olarak mümkün değildir.
Bu zorluğu aşmak için biz doğrudan olmadan Sükroz degrade Santrifüjü20,21, PSD kesir yalıtır ve PSD yalıtım için uygun tek bir sıçan hippocampi revize daha basit bir yöntem adapte olması beyin. Bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi hakkında verimleri 30-50 µg 2 hippocampi, immunoprecipitation ve Western Blot de dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal testleri kullanmak için yeterli dan PSD proteinlerin. Western Blot PSD zenginleştirme (PSD-95) postsinaptik yoğunluğu protein 95 ve presynaptic işaret synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin dışlanması ifşa tarafından izole için bizim yöntem başarısını gösterir. Bizim ECS indüksiyon ve küçük ölçekli PSD ayırma yöntemleri diğer kemirgen beyin bölgelerine kolayca uyarlanabilir ve PSD proteinlerin ifade ECS etkilerini değerlendirmek için nispeten basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz onların hippocampi nöronal aktivite küresel uyarılması ortaya çıkarır bir ECS indüksiyon yöntemi Sıçanlarda açıklayın. ECS Elektrokonvulsif terapi, klinik olarak insanlar1,2,3‘ te uyuşturucu ateşe dayanıklı depresif bozuklukların tedavisinde kullanılır hayvan bir modeldir. Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon tedavisi için kullanılmasına rağmen kesin altta yatan mekanizma belirsizdir….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Eric C. Bolton onun santrifüj ayırma ve Dr. Graham H. Diering için bize PSD ayırma için küçük ölçekli kuralıyla sağlamak için John Hopkins Üniversitesi’nde Dr. Richard L. Huganir’ın laboratuarında kullanmak izin verdiğiniz için teşekkür ederim.
Materials
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
Referências
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine’s scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
