끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스
Summary
우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.
Abstract
부분 hepatectomy 간 재생 및 다양 한 병 적인 조건에서 세포 기반 치료제의 효과 공부 하는 다양 하 고 재현할 수 방법입니다. 또한 부분 hepatectomy에 간 쪽으로 가속 neovascularization 및 셀에 의해 증가 engraftment와 이식된 세포의 증식 촉진 한다. 여기, 우리 immunodeficient 끄 덕을 결합 하 여 비만 아닌 당뇨병/심한의 비장에 30 %hepatectomy 이식 세포의 수행에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스.
이 절차에서는 두 개의 작은 절 개 만들어집니다. 첫 번째 절 개 노출 하 고, 간 좌 엽을 resect 하는 것입니다 그리고 또 다른 작은 절 개 비장 세포의 intrasplenic 이식에 대 한 폭로 이루어집니다. 이 절차는 어떤 전문된 외과 기술이 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 5-7 분 더 적은 스트레스와 고통, 빠른 복구, 및 더 나은 생존에에서 완료 될 수 있다. 우리 마우스 (유전자 변형 C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), 뿐만 아니라 부분적으로 hepatectomized 끄 덕에에서 인간의 기원 (NeoHep)의 세포 처럼 hepatocyte 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)에서 절연 hepatocytes의 이식 설명 했다. SCID 쥐입니다.
Introduction
현재, hepatocyte 이식 데 심한 간 장애 환자 치료에 대 한 전체 장기 이식의 대 안으로 제시 된다. 그것은 전체 장기 이식1환자 다리 수 믿 었 다. Allogenic hepatocytes2뿐만 아니라 xenogenic hepatocytes3 및 줄기 세포4 에서 파생 된 hepatocytes는 또한 되 고 조사 동물 모델에서. 이 컨텍스트, 추적 및 engraftment 받는 사람에서 이식된 세포의 잠재력 급성 간장 장애 (AHF)에 따라 셀 치료에 대 한 중요 한 기준입니다.
조사 hepatocytes 또는 hepatocyte 같은 셀5의 이식, AHF 수술6 또는 약리학7 절차, 뒤에 세포 이식 동물 모델에서 만들어집니다. 약리학 적인 시 약, 많은 hepatotoxins d galactosamine8, 아 세트 아미노 펜9, 사염화 탄소10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 AHF 동물 모델을 , 등., 사용 되었습니다. 이 목록에서 모든 시 약 AHF, 독특한 기능 집합이 생성 하지만 불행히도 아무 단일 시 약 인간의 AHF 모방. 또한, hepatotoxins에 의해 유도 된 AHF는 시간이 오래 걸립니다, 만성 스트레스는 동물을 박 았, 그리고 재현성 결과 얻기 어렵다.
다른 한편으로, 부분 hepatectomy (PHx)의 수술은 기술 종속, 고 재현성 결과 필요한 능력 개발 후 얻을 쉽습니다. 혼자 외 과적으로 AHF을 유도, 간 70% 이상의 절제가 필요; 그러나, 70 %hepatectomy 여전히 engraftment의 확산을 공부 하 고 이용 될 수 있다 보다는 더 적은 셀 간 손상14동안 그들의 치료 용량을 분석 하기 위한 간 이식. Hepatocytes의 이식 복15, 꼬리 정 맥16,17간 정 맥 또는 비장18통해 수행된 게시물 hepatectomy 되었습니다. 현재, 간 정 맥 주입 및 hepatocytes의 intrasplenic 이식으로 재현 하기 쉬운 기본 절차입니다.
이 문서에 우리는 30% 부분 hepatectomy 끄 덕에 대 한 절차를 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스의 왼쪽된 엽 excised입니다. 그것은 이식의 0.2 백만 GFP 표현 마우스 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytes 인간의 기원 NeoHep19 비장에 옵니다. 이 절차에에서 이식된 세포의 engraftment 이끌어 낸다. 이 절차는 최소한 침략 적 및 최소한 고통 스러운 기술.
Protocol
Representative Results
Discussion
부분 hepatectomy 조사 간 재생에 대 한 설립된 기술 이며 과도 한 hepatectomy AHF 모델을 모방 하기 위해 보고. AHF의 동물 모델 중 특히 쥐, 설치류는 가장 연구 모델입니다. 최대 70 %hepatectomy 쥐에서 간 상해 모델을 얻기 위해 좋은 생존 율25,26보고 되었습니다. 그러나 누드 및 다른 immunodeficient 마우스, 70 %hepatectomy 치명적으로 알려졌다 고 동물27</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 학과 생명 공학, 면역학, 뉴델리의 국립 연구소에 인도 정부에서에서 받은 코어 그랜트에 의해 지원 되었다. 박사 Bhattacharjee의 현재 주소는 사단의 위장, 간장 학과 및 영양, 아동 병원 로스 앤젤레스.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
Referências
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