Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse
Summary
Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.
Abstract
Teilweise Hepatektomie ist eine vielseitige und reproduzierbare Methode zur Leberregeneration und die Wirkung von zellbasierten Therapie in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu studieren. Partielle Hepatektomie erleichtert auch die erhöhte Engraftment und Proliferation von transplantierten Zellen durch beschleunigte Neovaskularisation und Zellwanderung auf der Leber. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für immungeschwächte NOD 30 % Hepatektomie und Transplantation von Zellen in der Milz ein nicht adipösen Diabetiker/schwere Ausführung kombiniert werden. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Maus.
Bei diesem Verfahren werden zwei kleine Hautschnitte vorgenommen. Der erste Schnitt ist zu entlarven und den linken Leberlappen resezieren, und ein weiterer kleiner Schnitt erfolgt, die Milz für die intrasplenic Transplantation von Zellen verfügbar zu machen. Dieses Verfahren erfordert keine speziellen chirurgische Fähigkeiten nicht, und es kann in ca. 5-7 Minuten mit weniger Stress und Schmerzen, schnellere Genesung und bessere Überlebensrate abgeschlossen werden. Wir haben die Transplantation von Leberzellen isoliert von einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit dem Ausdruck ihrer Maus (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) sowie Hepatozyten wie Zellen menschlichen Ursprungs (NeoHep) in teilweise Hepatectomized NOD bewiesen. SCID-Mäuse.
Introduction
Als Alternative zur gesamten Organ-Transplantation zur Behandlung von Patienten mit schweren Lebererkrankungen wird derzeit Hepatozyten Transplantation vorgeschlagen. Es wird vermutet, dass es Patienten auf ganze Organ Transplantation1überbrücken kann. Neben der allogenen Hepatozyten2werden xenogenen Hepatozyten3 und Hepatozyten abgeleitet von Stammzellen4 auch in Tiermodellen untersucht. In diesem Zusammenhang, das Homing und Engraftment ist Potenzial der transplantierten Zellen des Empfängers ein wichtiges Kriterium für zellbasierte Therapie im akuten Leberversagen (AHF).
Für die Untersuchung der Transplantation von Leberzellen oder Hepatozyten-wie Zellen5, entsteht AHF in einem Tiermodell durch chirurgische6 oder pharmakologische7 Verfahren durch die Transplantation von Zellen. Zu Tiermodell AHF durch pharmakologische Reagenzien, viele Hepatotoxins wie Paracetamol9, Carbon Titantetrachlorid10, Thioacetamide11, d-Galactosamin8, Concanavalin A12, Lipopolysaccharid13 , etc.., verwendet wurden. Aus dieser Liste jedes Reagenz erzeugt einen eindeutigen Satz von Funktionen für AHF, aber leider keinen einzigen Reagenz imitiert menschliche AHF. Darüber hinaus die AHF induziert durch Hepatotoxins dauert eine lange Zeit, die Tiere unter Dauerstress setzt, und reproduzierbare Ergebnisse sind schwer zu bekommen.
Auf der anderen Seite die chirurgische Verfahren der partiellen Hepatektomie (PHx) ist Geschick abhängig, und reproduzierbare Ergebnisse sind leicht zu beschaffen, nach der Entwicklung der erforderlichen Fähigkeiten. AHF durch einen chirurgischen Eingriff allein zu induzieren, ist die Resektion von mehr als 70 % der Leber erforderlich; jedoch verpflanzt weniger als eine 70 % Hepatektomie noch genutzt werden kann, um Studie Engraftment und Proliferation von Zellen in der Leber für die Analyse ihrer therapeutischen Kapazität bei Leberschäden14. Die Transplantation von Leberzellen wurden durchgeführt Post Hepatektomie durch das Peritoneum15, Tail Vene16, Lebervene17oder die Milz-18. Derzeit Lebervene Infusion und intrasplenic Transplantation von Leberzellen das bevorzugte Verfahren, da sie leichter zu reproduzieren.
In diesem Papier haben wir ein Verfahren für eine 30 % teilweise Hepatektomie in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscid/J) Mäuse, in denen die linken Leberlappen herausgeschnitten. Es folgt durch Transplantation von 0,2 Millionen GFP mit dem Ausdruck ihrer Maus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) Hepatozyten sowie menschlichen Ursprungs NeoHep19 in der Milz. Dieses Verfahren führt zu Engraftment der transplantierten Zellen in der Leber. Dieses Verfahren ist die wenigsten invasive und minimal schmerzhaft Technik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Partielle Hepatektomie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung Leberregeneration und übermäßige Hepatektomie wird berichtet, dass der AHF-Modell zu imitieren. Tiermodelle der AHF gehören Nagetiere, insbesondere Mäuse, das am besten untersuchte Modell. Um eine Schädigung der Leber-Modell bei Mäusen bis zu einer 70 % Hepatektomie zu erhalten wurde mit einer guten überleben Rate25,26gemeldet. Aber nackt und andere immungeschwächte Maus, eine 70 % Hepat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Kern Grant erhielt von der Abteilung Biotechnologie, Regierung von Indien, dem nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi unterstützt. Dr. Bhattacharjee aktuelle Adresse ist die Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Ernährung, Kinder Hospital Los Angeles.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
Referências
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