Isolation i Endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod
Summary
Målet med denne protokol er at isolere endotelceller stamceller fra navlestrengsblod. Nogle af applikationer omfatter brug af disse celler som en biomarkør for at identificere patienter med hjerte-kar-risiko, behandling af iskæmisk sygdomme, og at skabe væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner.
Abstract
Eksistens i endothelial stamceller (EPCs) i perifert blod og sit engagement i vasculogenesis blev først rapporteret af Ashara og kolleger1. Senere, dokumenteret andre eksistensen af lignende typer af EPCs stammer fra knoglemarven2,3. Mere nylig, Yoder og Ingram viste at EPCs stammer fra navlestrengsblod havde en højere proliferativ potentiale i forhold til dem isoleret fra voksen perifere blod4,5,6. Ud over at være involveret i postnatal vasculogenesis, har EPCs også vist lovende som en celle kilde til oprettelse af væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner7,8. Forskellige isolation protokoller findes, hvoraf nogle omfatter celle sortering af mononukleære celler (multinationale selskaber), der stammer fra kilder nævnt tidligere ved hjælp af endotel og hæmatopoietisk markører, eller dyrkning af disse multinationale selskaber med specialiserede endotel vækst medium, eller en kombination af disse teknikker9. Her præsenterer vi en protokol til isolering og kultur af EPCs ved hjælp af specialiseret endotel medium suppleret med vækstfaktorer, uden brug af immunosorting, efterfulgt af en karakterisering af isolerede celler ved hjælp af Western blotting og immunfarvning.
Introduction
Flere forskere har studeret karakteristika og potentiale af menneskelige EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan betegnes som cirkulerende celler, der har evnen til at overholde endotel væv i lokaliteter af hypoxi, iskæmi, skade eller tumordannelse og bidrage til dannelsen af nye vaskulære strukturer4,14. Deres observerede inddragelse i neovascularization, i form af postnatal vasculogenesis, har ført til en forståelse af Patofysiologi af disse celler og deres anvendelse i terapeutiske anvendelser4,15, 16. antallet af EPCs i individ har vist sig at være korreleret med hjerte-kar-patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andre undersøgelser har også opdelte EPCs ind i en ventil fibroblast-lignende fænotype og foreslået, at disse celler kan bruges til vævsmanipulering hjerte ventiler7,21.
Bestemt celle overflade molekyler nødvendigt at isolere EPCs er ikke blevet klart identificeret på grund af uoverensstemmelser mellem undersøgelser4. Vedhæftning af multinationale selskaber til en bestemt matrix, med udsættelse for en række dyrkningsbetingelser, er udført af flere grupper1,17,22,23, tyder på, at formodede EPCs kan vise forskellige fænotypiske egenskaber. Disse egenskaber omfatter manglende phagocytotic evne, tube dannelse i Matrigel og optagelsen af Dil-acetyleret low-density lipoprotein. Høj clonogenic og proliferativ potentiale er to egenskaber med hvilke EPCs kan være hierarchized5. EPCs kan også indgå i vitro tubuli når cocultured med menneskelige fosterets lunge fibroblaster4. Disse celler er kendt for at udtrykke endotel celle overflade markører og at dele nogle af hæmatopoietisk markører13,24,25. De positivt udtryk markører, der er bredt accepteret til fænotyper EPCs er CD31, CD34, vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrands faktor (vWF), CD133, c-Kit, og vaskulære endotel cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler, der co express CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-glat muskel aktin (α-SMA) ikke anses for at være EPCs på grund af deres begrænsede proliferativ potentielle, evne til at phagocytosis bakterier, og manglende evne til at danne de novo menneskelige fartøjer i vivo4,7. Denne artikel beskriver en modificeret protokol for isolation i endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod uden behov for enhver celle sortering protokoller. Til denne artikel brugt vi CD31, CD34 og VEGFR2 som de positive markører, med α-SMA som negativ indikator.
I denne artikel foreslår vi en metode til at isolere og dyrkning endotelceller stamceller fra navlestrengsblod uden celle sortering ved hjælp af specialiseret endotel vækstmediet suppleret med vækstfaktorer (EGM). Denne EGM indeholder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF), som forbedrer overlevelsen, spredning og migration af endothelceller26. Det omfatter også ascorbinsyre, som er ansvarlig for at vedligeholde den brostensbelagte morfologi af celler; insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1), som giver angiogene og vandrende funktion; og heparin, som medfører forbedret stabilitet på lang sigt af vækstfaktorer i de mellemstore26. Andre vækstfaktorer, tilføjes i endothelial cellekulturmedium omfatter tilskud med epidermal vækst faktor (EGF), som hjælper med at stimulere celleproliferation og differentiering og hydrocortison, som sensitizes celler til EGF26 . Vi viser, at brugen af denne særlige vækstmedium giver højere antal EPCs sammenlignet med endotel basal medium (EBM) eller Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Som tidligere nævnt tilhænger EPCs besidder en cobblestone morfologi. Vores isolerede Middelhavstredjelandene skred fra en spindel-formet celle koloni (figur 2A-2D) i de tidlige stadier til en cobblestone koloni (figur 2E-2F) over en periode af ti dage i kultur. EPCs er blevet stemplet forskelligt af forskellige forskergrupper, nemlig som sent endotel stamfader celler10, endotel kolonidannende celler<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr. CMMI-1452943 og af University of Arkansas udmærkelse College. Vi vil også gerne anerkende Arkansas ledning blodbank for at forsyne os med ledningen blod enheder.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
Referências
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
