인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

Summary

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

Abstract

내 피 조상 세포 (Epc) 말 초 혈액에서의 존재와 vasculogenesis에의 참여 Ashara와 동료¹에 의해 처음 보고 되었다. 나중에, 다른 비슷한 유형의 골^2,3에서 발생 하는 Epc의 실존 문서화. 더 최근에, 요더와 Epc 탯 줄 혈액에서 파생 했다 잉 그램은 높은 증식 잠재력 성인 주변에서 고립 된 사람에 비해 혈액^4,,56했다. 출생 후 vasculogenesis에 참여 하 고, 떨어져 Epc 또한 나타났습니다 약속 만드는 조직 설계 혈관 및 심장 밸브 구조^7,8셀 원본으로. 존재 하는 다양 한 격리 프로토콜, 일부는 포함 하는 단 세포 (MNCs) 내 피 및 조 혈 마커의 도움으로 설명한 소스에서 파생 된 셀 정렬 또는 특수 내 피 성장 이러한 MNCs를 경작 중간, 또는 이러한 기법⁹의 조합. 여기, 선물이 고립에 대 한 프로토콜 및 사용 하 여 Epc의 문화 전문 내 피 중간 immunosorting, 뒤에 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 격리 된 세포의 특성의 사용 없이 성장 인자를 보충 하 고 immunostaining입니다.

Introduction

여러 조사 특성 및 인간의 Epc^{5,,1011,,1213}의 잠재력을 공부 했다. Epc 세포 저 산소 증, 허 혈, 부상, 또는 종양 형성의 사이트에 내 피 조직에 고착 하 고 새로운 혈관 구조^4,14의 형성에 기여 하는 능력을가지고 순환 이라고 할 수 있습니다. 출생 후 vasculogenesis의 형태로 neovascularization에 그들의 관찰된 관련 이상 이러한 세포의 치료 응용 프로그램^4,15, 에 그들의 사용에 대 한 이해를 주도하 고 있다 ¹⁶. 개인의 Epc 수 심장 혈관 병 리^{9,15,,1617,18,19와 상관을 보였다 ,20}. 다른 연구는 Epc 밸브 구와 같은 표현 형으로 분화 또한 있고이 세포 조직 공학 심장 밸브^7,21사용할 수 제안.

Epc를 분리 하는 데 필요한 특정 세포 표면 분자는 하지 명확 하 게 확인 되었습니다 조사⁴사이 불일치 때문에. 다양 한 문화 조건에 노출 특정 매트릭스 MNCs의 접착 여러 그룹^1,17,,2223, putative Epc 수 있습니다 제안에 의해 수행 되었습니다. 다른 phenotypic 속성을 표시 합니다. 이러한 속성에는 phagocytotic, Matrigel에 관 형성 능력과 Dil acetylated 저밀도 지 단백질의 이해의 부족 포함 됩니다. 높은 clonogenic 및 증식 잠재력 어떤 Epc hierarchized⁵수 하는 두 개의 속성이 있습니다. Epc 또한 생체 외에서 tubules 때 인간의 태아 폐 섬유 아 세포⁴cocultured를 형성할 수 있습니다. 이 세포는 내 피 세포 표면 마커를 표현 하 고 조 혈 마커^13,,2425의 일부를 공유 하 알려져 있습니다. 긍정적으로 표현된 마커를 형질 Epc에 대 한 널리 받아들여진다는 CD31, CD34, 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 2 (VEGFR2), 폰 Willebrand 인자 (vWF), CD133, c-Kit 및 혈관 내 피 cadherin (VE-cadherin)^{4 , 18}. 공동 CD90, CD45, CD14, CD115, 또는 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 표현 하는 세포 phagocytose 박테리아와 드 노 보 인간을 형성 하는 무 능력을 그들의 한정 된 증식 잠재력, 능력 때문에 Epc 수로 간주 되지 않습니다 선박 vivo에서^4,7. 이 문서는 수정 된 프로토콜 프로토콜 정렬 셀에 대 한 필요 없이 인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립에 대 한 설명. 이 문서에 대 한 CD31, CD34, 및 VEGFR2 부정적인 지표로 α-SMA와 긍정적인 마커로 사용 우리.

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 셀을 사용 하 여 정렬 없이 탯 줄 혈액에서 내 피 뿌리 세포를 배양 하는 방법 전문 성장 요인 (EGM) 보충 하는 내 피 성장 매체 제안 합니다. 이 EGM이 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 생존, 확산, 그리고 내 피 세포²⁶의 마이그레이션 향상 포함 되어 있습니다. 그것은 또한 포함 하는 셀;의 조약돌 형태를 유지 하는 의약품 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 신생 및 철새 기능; 그리고 헤 파 린,²⁶의 중간 성장 요인의 향상 된 장기 안정성을 하면. 내 피 세포 배양에 추가 다른 성장 인자 자극 세포 증식 및 분화, EGF^{26 하 셀 sensitizes 날린 데 도움이 표 피 성장 인자 (EGF)와 보완을 포함} . 우리는이 특정 성장 매체를 사용 하 여 내 피 기저 매체 (EBM) 또는 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)에 비해 Epc의 높은 숫자를 생성 보여줍니다.

Protocol

이 연구 아칸소 기관 검토 위원회 (승인 번호 16-04-722) 대학교의 승인을 실시 되었다. 탯 줄 혈액 단위 구 연산 인산 포도 당 (일일) 솔루션 아칸소 코드 혈액 은행에서 수집 그리고 저장에 대 한 요구 사항을 충족 하지 않았다 단위 연구에 대 한 기증 했다. 코드 혈액 단위 했다 주위 온도에 컬렉션의 24 시간 이내 실험실에 couriered. 1. 절연의 내 피 조상 세포 탯 줄 혈액에서 <…

Representative Results

절연 및 내 피 조상 세포의 확장:회로도 (그림 1) 전체 프로토콜을 묘사한 제공 됩니다. 다른 혈액 구성 요소 레이어 밀도 밀도 그라데이션 매체와 인간 탯 줄 혈액의 그라데이션 원심 다음 관찰 되었다. 콜라겐 치료 접시에 MNCs를 시드 시 식민지의 파생물 일 5와 7 (그림 2A) 사이 처음 관찰 되었다. 이?…

Discussion

앞에서 설명 했 듯이, 점착 Epc 조약돌 형태를가지고 있습니다. 우리의 절연된 MNCs 진행 스핀 들 모양의 셀 식민지 (그림 2A 2D)에서 초기 단계에 조약돌 식민지 (그림 2E-2 층) 문화에 10 일의 기간 동안. Epc는으로 분류 되었습니다 다른 연구 그룹에 의해 다르게 즉 늦은 내 피 조상 세포¹⁰, 셀⁵또는…

Materials

A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution	Thermofisher Scientific	14170-112
Ammonium Chloride	Stem Cell Technologies	7850
1X Phosphate Buffer Saline	Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
Glacial Acetic Acid	Amresco	0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
HEPES buffer	Thermofisher Scientific	15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Thermofisher Scientific	10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31	Abcam	ab28364	1:250 dilution  for Western blotting
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	1:100 dilution for Western blotting
α-SMA	abcam	ab5694	1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin	abcam	ab7291	1:2500 dilution for Western blotting
VEGFR2	abcam	sc504	1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
Valve interstitial cell lysate			Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10X Tris/Glycine/SDS buffer	Biorad	161-0772	Used as running buffer
10X Tris/Glycine buffer	Biorad	161-0771	Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane	Merck Millipore	IPFL0010	This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4X Laemmli sample buffer	Biorad	161-0747
2-mercaptoethanol	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX precast gel	Biorad	5671033
Prolong Gold antifade	Thermofisher Scientific	P36930	Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol	VWR Analytical	BDH1135-4LP