Ved hjælp af en tilpasset mikrofluid olfaktoriske Chip til billeddannelse af Neuronal aktivitet som reaktion på feromoner i mandlige C. Elegans hoved neuroner
Summary
Brugen af en tilpasset “olfaktoriske chip” for effektiv calcium billeddannelse af C. elegans mænd er beskrevet her. Undersøgelser af mandlige eksponering til glycerol og en pheromone er også vist.
Abstract
Brugen af calcium indikatorer har styrket vores forståelse af neurale dynamics og regulering. Nematode Caenorhabditis elegans, med sin helt kortlagt nervesystemet og gennemsigtig anatomi, præsenterer en ideel model for forståelse real-time neurale dynamics ved hjælp af calcium indikatorer. I kombination med mikrofluid teknologier og eksperimentelle design, er calcium-imaging studier ved hjælp af disse indikatorer udført i både fri bevægelse og fangne dyr. Men de fleste tidligere undersøgelser udnytte fældefangst enheder, såsom den olfaktoriske chip beskrevet i Chronis et al., har enheder, beregnet til brug i den mere almindelige hermafrodit, som den mindre fælles mand er både morfologisk og strukturelt ulige. En tilpasset olfaktoriske chip var designet og fremstillet til øget effektivitet i mandlige neuronal imaging med hjælp af unge voksne dyr. En tur blev indarbejdet i ormen lastning port til at rotere dyrene og give mulighed for adskillelse af de enkelte neuroner i en bilateral par i 2D billedbehandling. Orme er udsat for en kontrolleret strøm af lugtstof inden for mikrofluid enheden, som beskrevet i tidligere hermafrodit undersøgelser. Calcium transienter er derefter analyseret ved hjælp af open source-software ImageJ. Proceduren beskrevet heri bør give mulighed for en øget mængde af mand-baserede C. elegans calcium billeddiagnostiske undersøgelser, uddybe vores forståelse af mekanismerne i sex-specifikke neuronal signalering.
Introduction
Mikrofluid enheder give øget adgang til netop kontrollerede miljøer, hvori dyr, såsom nematode C. elegans, kan være eksperimentelt manipulerede1. Disse undersøgelser omfatter adfærdsmæssige assays, calcium billeddiagnostiske undersøgelser eller endda screeninger for specifikke fænotyper, hvilket resulterer i mere nøjagtige målinger af eksperimentelle resultater1,2,3,4, 5,6. Mikrofluidik giver mindre flydende betingelser hvorigennem detaljerede eksperimenter kan køres, mens du udnytter minimale mængder af reagenser. Der er en konstant produktion af nye mikrofluid enhed designs, og brugen af hver varierer fra arenaer, der giver mulighed for den naturlige sinusformet bevægelse af C. elegans i adfærdsmæssige assays og neurale imaging studier, at fælde enheder, der bruges i neurale billedbehandling og olfaktoriske undersøgelser, at enheder, som giver mulighed for høj overførselshastighed fænotypiske analyser i genetiske skærme4,5,6,7. Efter fabrikation af en master skimmel, mikrofluid enheder er billige at konstruere — givet genbrugelighed af master- og nem at bruge, giver mulighed for hurtige data generation via høj overførselshastighed undersøgelser. Fabrikation af enheder ved hjælp af polymerer såsom Polydimethylsiloxan (PDMS) giver mulighed for oprettelsen af nye enheder inden for timer.
Calcium imaging studier bruge genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) udtrykt i target-cellerne til at måle den neurale dynamikken i disse celler i realtid8,9,10,11. Den gennemsigtige karakter af C. elegans giver mulighed for optagelse af de fluorescerende forvaltningsniveauer disse proteiner i levende dyr. Traditionelt, GECIs stole på de grønne fluorescerende proteiner (NGL)-baseret sensor normal god landbrugspraksis-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), men nyere undersøgelser har tilpasset disse sensorer til at give mulighed for bedre signal-støj-forhold og rød-forskudt excitation profiler. Efter udviklingen af GCaMP3 proteiner med disse specifikationer har varieret, herunder sensorer som GCaMP6s og GCaMP6f (langsom og hurtig fluorescens off-priser, henholdsvis), samt RFP-Calmodulin-M13 peptid (ColbyBruce), som har en rød-forskudt aktivering profil. Kombinationen af disse GECIs med C. elegans celle-specifikke promotor gensekvenser kan målrette celler af interesse, især sensoriske neuroner12,13,14,15 , 16.
Mens C. elegans brugervenlighed i mikrofluid undersøgelser fremgår, har næsten alle undersøgelser fokuseret på hermafroditter. Trods mænd kun tegner sig for 0,01-0,02% af befolkningens vildtype, uvurderlig resultater kan opstå fra deres karakterisering. Mens den fysiske connectome af hermafrodit nervesystemet er blevet fuldt kortlagt for årtier17, stadig den mandlige connectome ufuldstændige, især i regionen hoved i den animalske18. Brugen af calcium imaging i hanner vil bidrage til at skabe en forståelse af det mandlige nervesystemet og de forskelle, der opstår mellem de to køn. Den mindre størrelse af C. elegans voksne hanner forhindrer effektiv og pålidelig diffusering i traditionelle olfaktoriske enheder beregnet til større hermafroditter lastning havne. For at løse dette, en modificeret version af Chronis olfaktoriske Chip19 blev udviklet med en smallere lastning port, en lavere kanal højde, og vender i den orm lastning port (som rotere dyret), giver mulighed for visualisering af bilaterale venstre/højre neuronal par. Dette design tillader: (1) effektive diffusering af unge voksne mænd, (2) en mere pålidelig orientering af dyr for visualisering af begge medlemmer af bilaterale parrede neuroner, og (3) den præcise billeddannelse af neurale aktivitet i mandlige neuroner.
I stigende grad viser undersøgelser, at C. elegans mænd reagere anderledes end hermafroditter til en række ascarosides (tilskrive) eller nematode feromoner20,21,22,23 ,24. Derfor er udvikle en forståelse af neurale dynamik og erklæringer inden for den mandlige connectome blevet endnu mere relevant. Mandlige C. elegans indeholder 87 sex-specifikke neuroner findes ikke i hermafrodit25,26, at ændre connectome i som-endnu ubestemt måder. At være i stand til at afbilde disse unikke neurale dynamik vil give os mulighed for bedre at forstå sex-specifikke svar og neurale repræsentationer.
Denne protokol beskriver brugen af en mand-tilpasset olfaktoriske chip til den neurale billeddannelse af mandlige C. elegans chemosensation. Nociceptive neuron aske reagerer pålideligt på 1 M glycerol hos mænd, i overensstemmelse med tidligere tvekønnede undersøgelser27. Eksponering for ascarosides kan fremkalde reaktioner, der er variabel fra dyr til dyr, der kræver et større antal dyr, der skal testes. Svar af mand-specifikke CEM neuroner har tidligere vist, gennem både Elektrofysiologi og calcium billeddiagnostiske undersøgelser, at reagere trinløst ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mandlige-tilpasset olfaktoriske chip indarbejder en tur i en smallere lastning port, som giver mulighed for mere kontrol af orientering og for den effektive diffusering af mandlige C. elegans. Dette giver mulighed for visualisering af både venstre og højre medlemmerne af neuronal bilaterale par, uden behov for z-stabling. Denne kurve fører til en orientering fra lodrette 100% af tiden i worms, hvor kun én bilaterale par henvender sig med et fluorescerende markør, såsom aske (figur …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Manuel Zimmer for at forsyne os med de oprindelige design-fil, der blev tilpasset til brug med hanner; Frank Schroeder til syntese og levering af tilskrive #3; Ross Lagoy for indsigt og bistand med billedbehandling og analyse; og Laura Aurilio for den master fabrikation og der, sammen med Christopher Chute, bidrog til gennemgangen af dette manuskript. Finansiering af dette arbejde blev fastsat under National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (js), National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) og Burroughs Wellcome karriere Award på den videnskabelige Interface (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
Referências
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
