Bestemmelse af sialinsyrer i lever- og mælkeprøver af vildtype og<em> CMAH</em> Knock-out Mus.
Summary
Vi beskriver en HPLC-baseret metode til bestemmelse af N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i muselever og mælk.
Abstract
CMAH (cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrehydroxylase) er ansvarlig for oxidationen af cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oxidere cytidinmonophosphat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonophosphat-N-glycolylneuraminsyre på grund af en primær exon deletion af CMAH genet. For at forstå virkningerne og konsekvenserne af manglen på CMAH-aktivitet mere detaljeret er en Cmah- knock-out-model i mus en stor interesse for grundlæggende og anvendt forskning. Analysemetoden til bestemmelse af fænotypen af denne musemodel er her beskrevet detaljeret og er baseret på påvisningen af både N-acetylneuraminsyre og N-glycolylenuraminsyre i leveren og mælken af vildtype- og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigives og derivatiseres med o-phenylendiamin for at danne fluorogene derivater, der efterfølgende kan analyseres ved HPLC. Den præsenterede protokol kan væreOgså ansøgt om analyse af mælke- og vævsprøver fra forskellige andre oprindelser og kan være til nytte for at undersøge nærings- og sundhedsvirkningerne af N-glycolylneuraminsyre.
Introduction
N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glycolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de mest almindelige sialinsyrer i de fleste pattedyr 1 . Selvom det er i stand til at syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til at producere Neu5Gc på grund af en primær exon deletion på CMAH genet kodende for en CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dogbaserede fødevarer kan være kostkilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , der fører til produktion af anti-Neu5Gc-antistoffer og derfor udløse et immunrespons mod Neu5Gc 7 . Denne diæt effekt af Neu5Gc formodes at bidrage til kronisk inflammation og forskellige andre sygdomme 8 , 9 , 10 . For fuldt ud at forstå virkningerne af Neu5Gc i hUmans, er en dyremodel til systematisk undersøgelse af virkningerne af fødevarebårne sialinsyrer meget ønskelig. Selv om protokoller baseret på polymerasekædereaktion (PCR) til analyse af knock-out-mus er veletablerede og en bekvem måde til den genotype vurdering, kræver den funktionelle analyse af fænotype på metabolisk niveau mere specifikke analysemetoder. Fænotypen af en Cmah- knock-out-musemodel kan vurderes ved at isolere og analysere sammensætningen af sialinsyrer i lever- eller mælkeprøver. Der er tidligere rapporteret om forskellige metoder til påvisning af sialinsyrer i dyrevæv. Reaktion af sialinsyrer med resorcinol 11 eller thiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen af et kromoforisk produkt og kan simpelthen analyseres ved hjælp af en platereaderbaseret opsætning, men kun den samlede sialiske Syreindhold kan bestemmes. Alternativt blev analysen af sialinsyrer også beskrevet under anvendelse af gaskromatografi13 , MALDI-ToF-massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . De mest anvendte sialinsyreanalysemetoder er imidlertid baseret på hydrolytisk frigivelse efterfulgt af fluorescensderivatisering og efterfølgende højtryksvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Den heri præsenterede protokol tillader den fænotypiske vurdering af homozygote Cmah- knock-out-mus ved analyse og kvantificering af de relative mængder af Neu5Gc af mælke- og leverprøver. Analysen blev udført under anvendelse af en standard HPLC opsætning med fluorescensdetektion. Det mest kritiske trin i denne fremgangsmåde er fremstillingen af anionbytterkolonnerne og udførelse af anionbytningskromatografi; At afsætte harpiksen ordentligt og at samle de rigtige vaske- og elueringsfraktioner t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af Natural Science Foundation of China (tildelingsnumre 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL) og 100 Foreign Talents Plan (tildelingsnummer JSB2014012 til JV).
Materials
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
Referências
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
- Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
- Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
- Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
- Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
- Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
- Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
- Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
- Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
- Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
- Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. +3)-+and+alpha(2+–>+6)-isomers.”>Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 –> 3)- and alpha(2 –> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
- Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
- Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
- Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).
