Эксперименты по фазе отделены гигантских однослойных везикул (GUVs) часто пренебрегают условия физиологического раствора. Эта работа представляет подходы для изучения влияния высокой солености буфера на разделение фаз жидкость жидкость в заряженном многокомпонентных GUVs как функция транс мембраны решение асимметрии и температуры.
Фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) экспонируется сосуществующих жидкость приказал и жидкости неупорядоченных домены общего биофизических инструмент исследовать липидный Рафт гипотезы. Многочисленные исследования, однако, игнорировать влияние условий физиологического раствора. На тот счет текущая работа представляет эффект засоленных буфера и транс мембраны решение асимметрии на разделение фаз жидкость жидкость в заряженных GUVs, от dioleylphosphatidylglycerol, яйцо сфингомиелин и холестерина. Последствия были изучены при изотермических и различных температурных условиях.
Мы описываем оборудования и экспериментальных стратегий для контроля стабильности сосуществующих жидкого доменов в заряженных везикулы условиях симметричных и асимметричных высокой солености раствора. Это включает в себя подход подготовить заряженных многокомпонентных GUVs в буфере засоленных при высоких температурах. Протокол предполагает возможность выполнить частичный обмен внешние решения простой разрежения шаг при сведении к минимуму везикул разрежения. Альтернативный подход представлен используя microfluidic устройство, которое позволяет для полного внешнего решения обмена. Изучались также влияние решения на разделение фаз при различных температурах. С этой целью мы представляем основные дизайна и полезности палаты управления внутренних построен температуры. Кроме того мы размышляем об оценке GUV фазового состояния, ловушки, связанные с ним и как обойти их.
С тех пор наблюдения микронного размера доменов в жидкость жидкость фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) по микроскопии флуоресцирования GUVs были использованы в качестве модели системы исследовать липидный Рафт гипотеза1,2 , 3 . Как район их свободностоящая бислой лежит в диапазоне, от биологических клеток, они являются подходящим имитирует плазменных мембран, показывая гипотетическая плоты. Были проведены многочисленные исследования по таким GUVs с везикулы, диспергированных в чистой воде, сахароза или низкой солености решения4,5,6,,78. Эти условия, однако, не отражает физиологически соответствующие воздействия засоленных сред и транс мембраны решение асимметрия биомембран, как условия для клеток.
В этой работе и в предыдущей публикации из нашей группы9фазовые состояния заряженных многокомпонентных GUVs были рассмотрены как функция присутствие соли и решения асимметрия через мембрану. GUVs были подготовлены из смеси различных соотношениях dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), яйцо сфингомиелин (eSM) и холестерина (Чхоль) раствора сахарозы (с осмолярности 210 мОсм/кг) или высокой солености буфера (100 мм NaCl, 10 мм трис, pH 7.5, 210 мОсм/кг). Выбор липидов было оправдано данных, уже полученных на схеме фаза этой смеси6,8.
Ряд методов для подготовки GUVs доступны в литературе10,,1112 (Обратите внимание, что здесь, мы не будем рассматривать те, связанных с передачей липидов из масляной основе в водной фазе 13 , 14 из-за опасность оставшихся нефтяных остатков в мембраны, которые могут повлиять на поведение фаза). Подготовка GUVs в буфере засоленных связан с конкретными проблемами. Для решения низкой ионной силы electroformation метод,1516 представляет быстрый способ подготовить GUVs в высоких урожаев с мало дефектов10,17. Метод основан на внесение слой липидов на проводящие поверхности (электродов), сушки их и увлажняет их водным раствором при применении переменного поля. Однако этот метод требует корректировки, если соли в растворе18,19. Предполагается, что движущей силой роста везикул, electroformation является электроосмос16 , препятствующее высокой проводимости20. Таким образом electroswelling GUVs в засоленных решения не является простой подход, как он требует оптимизации для различных концентраций соли присутствуют в решении отек. Гель помощь везикул, отек21,22 является потенциальной альтернативой electroformation с даже быстрее формирование раз. Этот подход основывается на расширенной липидных Фильм гидратации, когда гель (агарозы или поливинилового спирта (ПВС)) используется в качестве подложки. Эти подходы, однако, приходят с риском загрязнения мембраны в случае на основе агарозы отек23 и/или температуры ограничения как и в случае на основе ПВА отек. Аналогичным образом протокол расти GUVs на бумажной подложке целлюлозы недавно был установленным24. Общие вопросы этого метода являются отсутствие контроля над субстрата чистотой, а также использование большого количества липидов. В этой работе мы представляем и представить преимущества наиболее традиционным методом GUV подготовки, а именно спонтанные отек метод25,26. Он состоит из сушки липидного слоя на подложке реагирует, увлажняющий в атмосфере водяного пара и последующие припухлость в желаемое решение опухоль (см. Рисунок 1 и детали в разделе протокол). Этот метод не имеет контроля над распределением размер пузырьков и результаты в целом небольшие пузырьки по сравнению с методами, где производство оказывают электрического поля, полимерной подложке или microfluidic означает. Однако везикул качество и размер подходит для изучения мембраны фазового состояния как изучить здесь.
Создание асимметрия между решениями через везикул мембранных связано с определенными проблемами. Один из часто используемых подходов является прямым разрежения везикул подвеска в желаемого внешнего решения27,28. Однако это также снижает плотность распределения везикул. Другая стратегия заключается в медленно обмен внешние решения вокруг GUVs поселились в нижней части потока клетки, что позволяет для решения в – и outflux. Чтобы избежать беспокойства или даже потери везикулы с потоком, низкого расхода являются прикладной8, который делает этот подход время неэффективно. Кроме того ни один из этих подходов не гарантирует полное внешнее решение обмена. Очевидным решением является обездвижить пузырьки во избежание потерять их во время внешнего решения обмена. К примеру биотинилированным GUVs могут привязными на стрептавидина покрытием поверхности29. Однако этот подход может привести к композиционным вариации на придерживался и следовательно неприкрепленных мембраны сегментов30,31. Применение магнитных или электрических полей в ловушку везикулы результаты в навязывании мембраны напряженности32. Используя Оптический пинцет для улавливания везикул требует наличия ручкой прилагается (т.е. шарик), в то время как использование оптических носилках может включать в себя местное отопление33. Треппинг GUVs также может быть достигнуто путем выращивания их на Платиновый провода без окончательного отряд34. Однако это дает пузырьки, которые не являются изолированным и которые обычно связаны с провода или другие пузырьки, тонкий липидный трубы (тросов).
Представленные работы подчеркивает стратегии для преодоления вышеуказанных ограничений. Мы сначала представить подробное описание метода спонтанное отек адаптирована и оптимизирована для производства GUVs в засоленных буферов. Затем мы представляем два подхода к эффективно создавать асимметричные решения условий простой разрежения или использования microfluidic устройства. Потому, что наша цель заключается в анализе мембраны фазового состояния GUVs в условиях различных решений, в последующих разделах описываются критерии для успешного статистического анализа и настоящем подсказки для предотвращения ложных классификации.
Анализы при изотермических условиях, а также при различных температурах. Хотя температура control обычно работает, подробности о экспериментальный контроль температуры камеры редко описаны. Здесь представлен доме построен установки соблюдать GUVs в различных температурных условиях.
Успешное производство GUVs для фазы государственных наблюдений в условиях высокой солености симметричных и асимметричных
Протоколы, представленные здесь представляет стратегию для оценки влияния засоленных буфера и решения асимметрии на мембраны фазового состояния заряженных GUVs в широком диапазоне композиций. Одной из основных задач на пути к достижению этой цели было производство заряженных GUVs в засоленных буферов.
Мы успешно производит GUVs раствора сахарозы и высокой солевых буфера простой спонтанное отек подход, который включает в себя предварительное увлажнение шаг хранение липидной пленки и ночь окончательного гидратации шаг роста везикул. Важно отметить, что отложение липидов должно быть сделано на шероховатую пластину ПТФЭ для обеспечения даже липидов распространение приносить однослойных везикул. Кроме того важно выполнять каждый шаг во время подготовки пузырьков при температуре где липидных Фильм находится в состоянии этап однородных и жидкости. Иначе везикул населения может быть полидисперсных в составе и смещения окончательный населения фазового состояния анализа. Отдельный протокол для спонтанного отек GUVs урожайности везикул комок, который с одной стороны дает возможность вновь приостановить его в небольших объемах для получения высококонцентрированный везикул дисперсии и с другой стороны обеспечивает асимметричное решение условия через мембрану при сведении к минимуму разрежения везикулы8,28. Важно, что во время везикул разрежения или внешние решения обмена, внутри и вне osmolarities остаются соответствует как морфология изменений, вызванных осмолярности несоответствия могут вызывать или предотвратить Lo + Ld фазы разделения41 или, в случае гипотонический условиях, может привести к пузырьки лопаются.
Здесь попытки оптимизировать electroformation протоколы в высокой солености раствора в результате производства не GUVs ПВА помощь отек принесли multilamellar везикулы. Даже несмотря на то, что она требует больше времени подготовке и результаты пачками везикул нижней качества10,17, успешного производства заряженных везикулы спонтанное отек поставляется с дополнительными преимуществами. Это требует минимальных усилий пока что приводит к достаточно урожайности для статистического пакета анализа и, в отличие от electroformation, требовалось не сложного оборудования или оптимизации. Кроме того без загрязнений путем окисления липидов наблюдались42,43. По данным литературы не существует различий между липидной композиции везикулы и соответствующих запасов, от которых они были выращены7,17. Кроме того образование пузырьков на подложке из ПТФЭ не запрашивает включение любых загрязнений в отличие от помогал гель отек методы, где иностранные молекулы могут быть введены в субстрат23. Electroformation поставляется с дальнейшей недостатков, связанных с чрезмерной везикул разрежения, при создании условий асимметричные решения. GUVs, производимые electroformation обычно присутствуют как однородной дисперсии (в отличие от высококонцентрированных везикул подвеска в виде образующихся спонтанное отек комок). Любого разбавления внешние решения существенно ослабит количество пузырьков также. Кроме того на протяжении этой работы было отмечено, что DOPG/eSM/Чхоль GUVs производства electroformation в сахарозу стала нестабильной, если разводят в засоленных буфера. Флуоресценции от липидные пятна на микроскопа указал, что везикулы лопнет, прежде чем их визуального осмотра было возможно. Такая нестабильность может объясняться напряженности повышенные мембран пузырьков, подготовленный electroformation по сравнению с полученными спонтанное отек10.
Хотя везикул разрежения является простой и быстрый подход для создания асимметричных GUV решение условия, он только выполняет частичное решение внешний обмен, хотя до высокой доли (здесь: 95%, рис. 2), так как после разбавления, следы опухоль решение останется. Выбор степени внешней решения обмена является компромисс между закупорить вверх везикул комок вместе с отек решения (статья 2) и не разбавляя его слишком много. Следовательно мы ввели альтернативные microfluidic подход рассматривается в других разделах подробно37 , который позволяет для быстрого и полного внешнего решения обмена во время GUV этап государственных наблюдений для проверки замечания государства фазы для разреженных везикулы. Замечания государства вариаций фазы при переходе от симметричного асимметричное решение условий действительно наблюдались быть в согласии. Кроме того оба метода для создания асимметричных решение условий показано здесь сравнительно быстро (Сравните ссылка8) и прийти с не известных рисков изменения местных состав (Сравните ссылки30,31), увеличение напряженности мембраны (Сравните ссылка32), или местное отопление (сравнить ссылку33), что касается альтернативных методов обсуждаются во введении. Во время microfluidic треппинга, осмотической баланс между везикул интерьера и экстерьера является не только важно избежать этапа состояние артефакты как упоминалось выше, но и дефляция, вызванные условиями гипертонический раствор может привести к ловушке GUVs скольжения через должности после обмена внешнего решения.
Даже несмотря на то, что успешно применяется спонтанные опухоли расти нетарифицируемых везикулы от системы DOPC/eSM/Чхоль, в других случаях, отсутствие обвинений может ухудшить GUV опухоль в результате отсутствия отталкивания между отдельными бислоев44 . Продление периода предварительно отек или представляя громоздкие липидов headgroups может противостоять этот выпуск45. Кроме того везикул стабильности после их растворения в решения, отличающегося от того, используется для набухания могут отличаться для разных липидной композиции и разбавления СМИ, которые мы не исследовали здесь. Мы также не изучили возможность настройки средний диаметр GUV с методом подготовки, представленные здесь. Но такие параметры, как состав везикул и отек решения могут повлиять на результаты. Применение альтернативных методов46 может принести большие пузырьки липиды и решения, используемые здесь, однако, они могут прийти с другие недостатки, связанные с методом. Выше подход для производства GUVs в условиях высокой солености симметричных и асимметричных потенциальным средством для дальнейшего исследования везикулы состоит из композиций различных липидов и рассеяны в различных средствах массовой информации. Как мы еще не изучили эти возможности, будущие испытания покажет, как правило, могут быть применены методы приготовления и разбавления GUV.
Наблюдения за разделение фаз при различных температурах
Существуют различные экспериментальные установки, подходит для изучения GUVs при различных температурах. Хотя эти настройки не часто подробно описаны в литературе, текущая работа представляет сборку основных применимых для таких исследований.
_content «> контрольных измерений показывают, что температура этого дом спроектирован и построен камеры точно контролируется термостатом и градиенты температуры внутри камеры находятся в экспериментальной температуры резолюции. Это обеспечивается, что экспериментальный температурных условиях согласуются с чтением термостата.
В ходе оценки GUV фазы государств в широком температурном диапазоне важно, что наблюдаемые везикулы хорошо достижение равновесного уровня после изменения температуры. Один из возможных способов обеспечения этого является для проверки гистерезиса. Если присутствует гистерезиса, следует понизить температуру шаги и/или уравновешивания раз увеличилась. Как температура контроля в этой работе устанавливается на водной основе термостат, диапазон рабочих температур идеально ограничивается 0 – 100 ° C. Этот диапазон может быть расширена с помощью других температуры контроля жидкостей, таких как масло или путем применения других настроек, например устройство Пельтье. На практике Рабочая температура ограничивается также возможной конденсации или испарения. Кроме того для температур от комнатной температуры, становится более вероятным возникновение градиента температуры установившемся через камеры наблюдения. Кроме того изображения оборудования может быть причинен вред при экстремальных температурах. Для типичных температурные диапазоны для исследования везикул липидов (~ 10-50 ° C7,9) повреждения оборудования наблюдения следует рассматривать, но обычно не ожидается.
Везикул домен наблюдения артефакты
Существует ряд источников для наблюдения артефактов с помощью микроскопии флуоресцирования поля. Прежде всего следует знать, что максимальное разрешение r применяется для визуального осмотра везикул фазовые состояния объекта определяет предел обнаружения липидных доменов:
где λ является длина волны излучения, и NA числовой апертуры цели. Типичная задача с 40 x увеличение и NA 0,6, который обнаруживает зеленый выбросов свет около 560 Нм достигнет оптическое разрешение ~0.6 µm. Следовательно, исследования, которые сравнить фазовые состояния везикулы, производится из смеси особенно липидов среди различных условия следует использовать ту же цель та же смесь липидов.
Другой артефакт является возникновение липидных доменов вследствие фото окисление липидов вследствие длительного воздействия на возбуждения света41. Фото ущерб возникает преференциально на постановление липидов непредельных углеводородов. В самом деле, для некоторых композиций липидов, такой домен формирования первоначально однородной везикулы было отмечено здесь после длительного периода возбуждения освещенности (~ 30 s). Чтобы противостоять этому вопросу, возбуждения свет продержали сосредоточены в одном поле зрения всего несколько секунд для оценки состояния фазы. Следовательно DiIC18 был подходит для наших целей. Другие красители, однако, может быть гораздо более чувствительны и могут необходимо обрабатывать в нижней возбуждения интенсивности и с более коротким временем освещенности возбуждения.
Механическое напряжение сдвига от пипетки передачи везикулы потенциально смешивает домены временно, тем самым искажения фазы поведение явно везикул. Для некоторых пакетов, различные везикулы показал поведения различными этап 0 мин и 5 мин после пипеткой перенести на Микроскоп coverslip. Также было показано касательное напряжение, вызванного потока жидкости в устройстве microfluidic привести в домене смешивания47. Везикулы следует оставить нетронутыми на достаточное количество времени для уравновешивания до наблюдения. В рамках этого исследования везикулы, захваченных на устройстве microfluidic остались спокойно за 1 ч после загрузки везикул и решения обменов до наблюдения.
Чтобы избежать некоторых из вышеупомянутых трудностей, а также ограничений, введенных света дифракционный предел, альтернативные методы, такие как ЯМР спектроскопии48 или методы микроскопии сверхвысокого разрешения49 могут быть использованы.
Выводы и перспективы
Представленная работа демонстрирует набор методов, который позволяет для анализа влияния условий засоленных симметричные и асимметричные решения на разделение фаз мембраны. Все представленные методы подходят для других приложений. Microfluidic устройство например обеспечивает платформу для изучения кинетики домена формирования и исчезновения после индукции решения асимметрии. Кроме того внешний домен как функция концентрации соли могут рассматриваться таким образом. Все методы могут также использоваться для взглянуть на влияние на поведение фазы, используя любые другие решения интерес.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа является частью MaxSynBio консорциум, который совместно финансируется федеральным министерством образования и научных исследований Германии и Общество Макса Планка.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt | Avanti Polar Lipids | 840475C | abbreviated as DOPG in the text |
chicken egg sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860061 | abbreviated as eSM |
cholesterol (ovine wool, > 98 %) | Avanti Polar Lipids | 700000 | abbreviated as Chol |
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Molecular Probes | D-282 | abbreviated as DiIC18 |
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) | Merck | ||
NaCl (> 99.8 %) | Roth | ||
HCl (37 %) | Roth | ||
Tris (≥ 99.9 %) | Roth | ||
Sucrose (≥ 99.5 %) | Sigma Aldrich | ||
Parafilm | |||
Threaded vial 45×27 mm, 15 mL | Kimble | Soda flat bottom, white screw cap | |
pH meter | Mettler Toledo | MP220 | |
Osmometer | Gonotec | Osmomat030 | |
Epi-fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer D1 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
Objective 40x, 0.6 NA | Zeiss | LD Achroplan | |
Objective 40x, 0.75 NA | Leica | 506174 | |
Objective 63x, 0.9 NA | Leica | 506148 | |
Microscope slide, 56×26 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläser | ||
Cover slip, 22×22 mm, 0.17 ± 0.01 mm | Menzel-Gläaser | ||
Parafilm "M" | Bremix Flexible Packaging | ||
Syringes, 5 mL, 10 mL | Braun | ||
0.45 µm syringe filter | GVS North America | Cameo 25AS, 1213723 | Acetate, sterile |