Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler
Summary
Her presenterer vi protokoller for vaskemiddel uten homogenisering kulturperler pattedyrceller basert på nitrogen kavitasjon og påfølgende separasjon av cytosolic og membran-bundet proteiner av ultracentrifugation. Denne metoden er ideelt for overvåking partisjonering av ytre membran proteiner mellom vannløselige og membran fraksjoner.
Abstract
Kultivert celler er nyttige for å studere subcellular distribusjon av proteiner, inkludert eksterne membran proteiner. Genetisk kodet fluorescently har merket proteiner revolusjonert studiet av subcellular protein distribusjon. Men er det vanskelig å kvantifisere distribusjon med fluorescerende mikroskopi, spesielt når proteiner er delvis cytosolic. Videre er det ofte viktig å studere endogene proteiner. Biokjemisk søk som immunoblots være gullstandarden for kvantifisering av protein fordeling etter subcellular fraksjoneres. Selv om det kommersielle kits som mål å isolere cytosolic eller visse membran brøker, er de fleste av disse pakkene basert på ekstraksjon med vaskemidler, som kan være uegnet for å studere ytre membran proteiner som er lett ut membraner. Her presenterer vi en vaskemiddel uten protokoll for mobilnettet homogenisering av nitrogen kavitasjon og påfølgende separasjon av cytosolic og membran-bundet proteiner av ultracentrifugation. Vi bekrefte separasjon av subcellular organeller i løselig og pellets fraksjoner over forskjellige celletyper, og sammenligne protein utvinning blant flere vanlige ikke-vaskemiddel-baserte mekanisk homogenisering metoder. Blant flere fordeler av nitrogen er kavitasjon overlegen effektiviteten av mobilnettet avbrudd med minimal fysiske og kjemiske skade delikat organeller. Kombinert med ultracentrifugation, nitrogen kavitasjon er en utmerket metode for å undersøke skifte av ytre membran proteiner mellom cytosolic og membran fraksjoner.
Introduction
Mobilnettet proteiner kan deles inn i to klasser: de som er forbundet med membraner og de som ikke. Non-membran tilhørende proteiner finnes i stoffer, nucleoplasm og lumina av organelles som det endoplasmatiske retikulum (ER). Det er to klasser av membran-assosiert proteiner, integrert og tilbehør. Integrert membran proteiner er også transmembrane proteiner fordi ett eller flere segmenter av polypeptid kjeden spenner over membranen, vanligvis som en α-helix består av hydrofobe aminosyrer. Transmembrane proteiner inn co-translationally membraner i deres biosyntesen og være så konfigurert til de er catabolized. Ytre membran proteiner er sekundært kjørt til membraner, vanligvis av post-translasjonell modifikasjon med hydrofobe molekyler som lipider. I motsetning til integrert membran proteiner, foreningen av ytre membran proteiner med mobilnettet membraner er reversibel og kan reguleres. Mange ytre membran proteiner funksjonen signalveier og regulert tilknytning membraner er en mekanisme for aktivering eller hemme en sti. Et eksempel på en signalnettverk molekyl som er et protein som ytre membran er den lille GTPase, RAS. Etter en rekke post-translasjonell endringer omfatter modifisering med en farnesyl lipid, endret C-terminus en eldre RAS protein setter inn i cytoplasmatiske heftet av mobilnettet membranen. Spesielt er plasma membranen der RAS engasjerer sin nedstrøms effektor RAF1. For å hindre konstituerende aktivering av mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) veien, er flere nivåer av kontroll av RAS på plass. Foruten gjengivelse RAS inaktive av hydrolyzing GTP i BNP, kan aktive RAS også frigis fra plasma membranen av endringer eller interaksjon med solubilizing faktorer å hemme signalering. Selv om fluorescerende live bildebehandling gir celle biologer muligheten til å observere den subcellular lokaliseringen av fluorescerende protein-merket eksterne membran proteiner1, fortsatt det kritisk behov for å vurdere membran sammenslutning av endogene proteiner semi kvantitativt med enkle biokjemiske tilnærminger.
Riktig biokjemiske evalueringen protein partisjonering mellom membranen og løselig fraksjoner er kritisk avhengig av to faktorer: cellular homogenisering og effektiv separasjon av membran og løselig fraksjoner. Selv om enkelte protokoller, inkludert den mest brukte kommersialiserte prosjektpakker, avhengig av vaskemiddel-baserte celle homogenisering, kan disse metodene Beskytt analyse av utdrager membran proteiner i løselig fase2. Følgelig, ikke-rengjøringsmiddel basert, mekanisk metoder for celle avbrudd gir renere resultater. Det finnes flere metoder for mekanisk avbrudd i celler dyrket i kultur eller høstet fra blod eller organer. Disse inkluderer Dounce homogenisering, tynn nål avbrudd, kulelager homogenisering, sonication og nitrogen kavitasjon. Her vi evaluerer nitrogen kavitasjon og sammenligne den med andre metoder. Nitrogen kavitasjon, avhengig av nitrogen som oppløses i cytoplasma cellene under høyt trykk. Etter balanse vises cellen suspensjon brått for lufttrykk slik at nitrogen bobler dannes i cytoplasma som rive åpne cellen av deres effervescence. Dersom trykket er tilstrekkelig høy, nitrogen effervescence kan forstyrre kjernen3 og membran-bundet organeller som lysosomer4. Men hvis trykket er lav nok, vil dekomprimeringen forstyrre plasma membranen og ER men ikke andre organeller, dermed smitte både stoffer og intakt cytoplasmatiske organeller til homogenate som er angitt på cavitate5. Derfor er nitrogen kavitasjon metoden for valg for å isolere organelles som lysosomer og mitokondrier.
Men er det også en utmerket måte å forberede en homogenate som lett kan deles inn i membranen og løselig fraksjoner. Trykk fartøyet (heretter kalt “bombe”) under kavitasjon består av en tykk rustfri stålet casing som tåler høyt trykk, med en vik for levering av nitrogen gassen fra en tank og en stikkontakt-port med en justerbar tømmeventil.
Nitrogen kavitasjon har vært brukt i cellen homogenisering siden 1960-tallet6. I 1961 etablerte jeger og Commerfold7 nitrogen kavitasjon som et levedyktig alternativ for pattedyr vev avbrudd. Siden da forskere har tilpasset teknikken til ulike celler og vev med suksess, og nitrogen kavitasjon har blitt en stift i flere programmer, inkludert membran forberedelse8,9, kjerner og organelle Forberedelse10,11og labil biokjemiske utvinning. Foreløpig ansette celle biologer oftere andre metoder for cellen homogenisering fordi fordelene av nitrogen homogenisering ikke har blitt viden annonseres, nitrogen bomber er dyrt og det er en misforståelse som et relativt stort antall celler nødvendig. Protokoller for nitrogen kavitasjon å oppnå celle-fri homogenates med intakt kjerner ikke er publisert, og mest publiserte evalueringer av 20 mL celle suspensjon ble brukt. For å tilpasse denne klassiske teknikken for gjeldende krav til arbeider med småskala prøver, presenterer vi endret protokollen nitrogen kavitasjon spesielt utformet for kulturperler celler. Etter nitrogen kavitasjon, homogenate deles i løselig (S) og membran (P) fraksjoner av differensial sentrifugering, først med en lav hastighet spin å fjerne kjerner og ubrutt celler, og deretter med en høyhastighets spinn (> 100 000 x g) å skille Membraner fra løselig brøkdel. Vi analysere effektiviteten av separasjon med immunoblots og sammenligne nitrogen kavitasjon med andre mekaniske avbrudd teknikker. Vi undersøker også osmotisk effekten av homogenisering buffer under nitrogen kavitasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordelene av nitrogen kavitasjon over andre metoder for mekanisk avbrudd er mange. Kanskje er den viktigste fordelen dens evne til å forsiktig, men effektivt homogenize eksemplarer. De fysiske prinsippene av dekompresjon avkjølt prøver i stedet for å generere lokale oppvarming skade som Ultralydutstyr og friksjon/klippe basert teknikker. Kavitasjon er også svært effektiv på å forstyrre plasma membranen. Fordi nitrogen bobler genereres i hver celle ved dekomprimering, kavitasjon prosessen begrenses ved cellestørr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av GM055279, CA116034 og CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
Referências
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
