Målet med de beteendemässiga tester som presenteras här är att upptäcka funktionella underskott hos råttor efter traumatisk hjärnskada. Fyra särskilda tester presenteras som upptäcker brister i beteenden att återspegla skadorna på specifika hjärnområden som ibland sträcker sig till ett år efter skadan.
Med den ökande förekomsten av traumatisk hjärnskada (TBI) i både civila och militära populationer anses TBI nu vara en kronisk sjukdom. några studier har dock undersökt långtidseffekter av skada i gnagare modeller av TBI. Här visas beteendemässiga åtgärder som är väletablerad i TBI forskning för gånger tidigt efter skadan, till exempel två veckor, fram till två månader. Några av dessa metoder har tidigare använts vid senare tidpunkter efter skada, upp till ett år, men mycket få laboratorier. Metoderna som visas här är en kort neurologisk bedömning att testa reflexer, en balk-balans att testa balans, en balk-promenad att testa balans och finmotorik samordning och en fungerande minne version av Morris vatten labyrinten som kan vara känslig för underskott i referera till minne. Hanråttor sköttes och pre utbildade till neurologiska, balansera, och finmotorik samordning tester innan du får parasagittal vätska slagverk skada (FPI) eller simulerad skada. Råttor kan testas på kort neurologisk bedömning (neuroscore), beam-balansen, och Beam-gå flera gånger, medan du testar på vatten labyrinten kan endast göras en gång. Denna skillnad beror på att råttor kan minnas uppgiften, alltså confounding resultaten om upprepad testning görs på samma djur. När du testar från en till tre dagar efter skada, upptäcks signifikanta skillnader i alla tre icke-kognitiva uppgifter. Skillnader i Beam-promenad uppgiften var dock inte upptäckas vid senare tidpunkter (efter 3 månader). Underskotten upptäcktes vid 3 månader i Beam-balans och 6 månader i neuroscore. Brister i arbetsminnet upptäcktes ut till 12 månader efter skada och ett underskott i ett referens-minne dök upp vid 12 månader. Beteendemässiga standardtest kan således vara användbara åtgärder av ihållande beteendemässiga underskott efter FPI.
De metoder som presenteras här är utformade för att identifiera funktionella underskott i specifika hjärnområden som induceras av en experimentell modell av TBI hos råtta. Fyra olika beteende tester kommer att beskrivas. Först kan kort neurologisk bedömning, kallas neuroscore, utföras utan att kräva någon specialiserad utrustning men kräver praxis. Detta test detekterar underskott i reflexer. Det andra upptäcker testet Beam-balans underskott i förmågan att balansera. Denna uppgift kräver hanteraren Poäng råtta baserat på en ordinal skala och kräver viss utbildning av hanteraren. Beam-balans testet kräver en smal stråle och är känslig för underskott i det vestibulära systemet. Det tredje testet bedömer vestibulomotor samordning. Detta test kallas Beam-promenad uppgiften, och även om det krävs några förberedande utbildning av råtta, proceduren är mer objektiva än två tidigare som fördröjning att korsa balken är ett objektivt mått som inte är beroende av subjektiva poängsättningen. Denna skillnad beror på tid att passera en smal stråle för att nå ett värdeskåp mäts. Beam-gångtestet kräver en längre balk än Beam-balansen samt en escape-box. Detta test mäter underskott i både motoriska koordination och balans och är därför känslig för skador på lillhjärnan och motor relaterade hjärnområden. Den fungerande minne versionen av Morris vatten labyrinten (MWM-WM) testar primärt Hippocampus funktion och integration med den prefrontala cortex eller verkställande funktion. Versionen av Morris vatten labyrinten visas kan också användas för att upptäcka brister i referens minne1.
Dessa metoder har valts utifrån deras väletablerade meritlista i litteraturen. Var och en har varit effektiv i många händer från olika laboratorier med flera stammar av råttor under många år av forskning. Men, i förflutnan åtgärder efter skada upp till två veckor efter skada ansågs ”kroniska” tidpunkter. Således, för att fastställa beteendemässiga tekniker för studier av kroniska effekter av TBI hos gnagare, dessa välkända metoder som behövs för att utvärderas för känslighet att upptäcka TBI inducerad underskott vid längre tidpunkter efter skada. Nu finns det flera gnagare modeller av TBI, FPI modellen är en av de mest använda, och används i denna studie. Denna modell publicerades första gången i 1950-talet2, och sedan dess har mer än 1000 papper anställd FPI i råttor3. Neuropatologi av denna typ av skada har varit väl beskrivna av oss4 och andra5,6,7. Kort, neuronal skada i hippocampus har visat sig vara dosberoende använder Fluoro-Jade färgning på kort tid efter skada, dvs., 24-48 h. samtidigt brutto atrofi och kavitation har inklusive gallring av den interna kapseln och hjärnbarken rapporterats på ett år efter skada6,7.
Den mest meningsfulla representationen av hjärnans funktion bedöms med beteendemässiga resultatåtgärder efter en experimentell hjärnskada. Men gör den stora majoriteten av FPI experiment som beteendemässiga missbruksproblemen åtgärder relativt tidigt, vanligtvis från 1 till 14 dagar efter skada. Med hjälp av metoder visat här, vissa beteendemässiga underskott kan upptäckas ut till 12 månader efter skada1. Neurologisk funktion, brutto vestibulomotor funktion och finmotorik samordning bedömdes efter skada dagar (PID) 1-3 och på 3, 6 och 12 månader efter operation, med hjälp av en kort neurologisk utvärdering (Neuroscore; modifierad från Schallert8), den Beam-balans uppgift och Beam-promenad uppgift9,10,11. Referens och arbetsminnet bedömdes med hjälp av en fungerande minne version av Morris vatten labyrint1,12,13.
När de utför någon typ av beteendemässiga testning, är det viktigt att vara konsekvent. Denna detalj innehåller många överväganden som verkar obetydlig men har stor inverkan på svaret från djuret. Ett viktigt steg som inte bör förbises är acklimatisering av djur till deras hem-bur/bostadssituationen innan några experiment. Denna förberedelse minskar effekterna av djurens fysiologiska stressreaktionen, som kan ändra beteende resultat18. Likaså är det absolut nödvändigt att alla ansträngningar görs för att hantera alla djur på samma sätt. Denna enhetlighet omfattar som tidigare nämnts acklimatisering till bostäder och även acklimatisering hantering och transport mellan rum före träning eller testning. Detta koncept kan inte överskattas. Slarvig djurhantering är katastrofalt till eventuella beteendemässiga testning19. Jämväl, varje ansträngning måste göras att testa djur vid samma tid på dagen, vare sig under sin mörk eller ljus cykel. För tester diskuteras här, är testning under ljusa eller mörka scenen acceptabla, så länge tester utförs konsekvent. Test gjort vid olika tidpunkter under dygnsrytm cykeln har visat sig förändra beteende resultat18,20. Dessutom måste hanteraren samt djuret i en stress fri, lugn stat för att maximera noggrannheten i resultaten.
Särskilt när det gäller Neuroscore är falska positiva och negativa vanliga. Falska positiva uppstår vanligtvis när ett djur inte är helt vana att hantering och testning. Djuret måste vara helt avslappnad så observerade svaret är reflexivt och inte på grund av muskler som skärpning från att reagera på stress eller rädsla. En spänd hanterare kan påverka resultaten genom att överföra stress för djuret. Därför kan håller råttan för hårt eller för löst både vara problematiska. Dessutom om hanteraren är nervös, kan detta förbrylla reaktionen av råttorna. Det finns också risken att en oerfaren observatör kommer misstolka råttans svar. Bra utbildning och en hel del övning är avgörande för framgång och konsekvens i Neuroscore.
I allmänhet, är den främsta oro med dessa tester avsaknaden av en stor skillnad, och ibland ingen skillnad, mellan behandlingsgrupperna. Eftersom djur kan reagerar olika på olika hanterare, ljud, tider av dagen och potentiellt, seasons21, måste alla ansträngningar göras att minska alla möjliga störfaktorer.
Resultaten av balk-balans och Beam-promenad uppgifter visas här visar att dessa tester är användbara tidigt efter skada att upptäcka brister i vestibulomotor funktion. Dessa underskott försvinner vanligtvis över tid1,14. I denna modell, har senast 6 månader efter skada, skada-inducerad underskotten löst. Resultaten av 6 månaders tidpunkten visar att det finns inga skillnader mellan NAIVE, SHAM eller skadade råttor; alla råttor har dock avkopplande i sina hem burar för 6 månader, åldrande och ökar i vikt. Således, när de är åter testade vid 6 månader efter operationen (eller motsvarande i fråga om NAIV), är de i huvudsak blir gamla och fett, och därför alla grupperna inte utför såväl som de jämfört med deras baslinjen dag 0 resultat.
En annan viktig faktor är att de beteende-test som används är rätt testet. Exempelvis är de tester som anställd här tänkt att representera funktionen av specifika hjärnområden. Ett exempel är det vestibulära systemet, vilket är viktigt för balansen. Områden i hjärnan involverad i sensomotorisk funktion, till exempel cortex inklusive sensorimotor cortex, thalamus, corticospinal nervceller, basala ganglierna, nigro-striatum, för att nämna några, är alla inblandade i vestibulomotor samordning. Således visar underskott i Beam-balans eller balk-promenad potentiella brister i dessa områden. Dessutom är hippocampus och prefrontala cortex inblandade i inlärning och minne funktioner testas av fungerande minne vatten labyrinten. Även när det korrekta testet är valt, måste begränsningarna av de tester som är anställda hållas i åtanke. Ingen av de tester som presenteras här är exempelvis känsliga till underskott i humör, såsom depression, ångest eller sociala interaktioner såsom aggression, fatta beslut eller impulsivitet. Jag upprepar, är det absolut nödvändigt att välja den lämpliga testet för området beteende och hjärnan ska utvärderas.
Tolkning och analys av beteendemässiga data måste hanteras med försiktighet. Det rekommenderas starkt att inkludera power analyser av varje typ av provning separat, eftersom använder en beteendevetenskaplig resultatet som ett mått på en neurala underskott, är till sin natur ett grovt mått på en subtil effekt. Olika tester kräver dessutom olika typer av statistiska analyser. Till exempel är Neuroscore och Beam-balans tester som beskrivs beroende av tolkningen av en utbildad observatör till Poäng beteendet med en ordinal skala. Dessa typer av data är inte kontinuerlig och inte normalfördelade, så icke-parametriska statistik bör användas, t ex Kruskal-Wallis test, vilket framgår i avsnitt 6.1 och 6.2. Alternativt den Beam-promenad och arbetande minnestester vatten labyrint producerar data som är kontinuerlig och normalfördelade, så parametrisk statistik kan användas, till exempel one-way ANOVA eller upprepade-åtgärder tvåvägs ANOVA, som framgår i avsnitt 6.3 och 6.4.
De beteendemässiga uppgifter som presenteras här har stått sig genom tiderna och ger reproducerbara resultat, särskilt när den är ihopparad med FPI modellen i råttor, även om många andra metoder för beteendemässiga testning för hjärnskada existerar. Neuroscore är en kort utvärdering som utförs med ett minimum av utrustning. Andra tester av reflexer och styrka finns tillgängliga och kan införlivas i en neurologisk bedömning, såsom laterala pulsion uppgiften, akinesi testet, lutande planet test och greppstyrka (se Fujimoto o.a. 22 och Gold et al. 23). the Beam-balans och Beam-promenad uppgifter som beskrivs är åtgärder av vestibulomotor underskott efter skada. Vestibulomotor samordning kan anses vara ett mått på brutto motoriska beteende, medan andra åtgärder av brutto motoriska brister omfatta Rotarod, den roterande Polen, och öppna fältet aktivitet. Förmågan att simma, är mätt som simma hastighet under vatten labyrinten, också en indikation på brutto finmotorik samordning22,23. Fungerande minne vatten labyrint uppgiften slutförs denna uppsättning tester av att upptäcka både referera minne underskott (indikeras av prövning 1) och arbetar minne underskott (indikeras av prövning 2 eller skillnaden mellan studie 1 och studie 2). Andra åtgärder av kognitiv funktion omfatta åtta arm radiella labyrinten, Barnes labyrinten, romanen objekt Igenkänningstestet och olika varianter av vatten labyrinten. Dessa varianter inkluderar ursprungliga Morris vatten labyrinten och Lashley III labyrinten (igen se Fujimoto o.a. 22 och Gold et al. 23). detta batteri av tester har visat sig vara användbara tidigt efter skada och, i varierande grad, ut till 12 månader efter skada1.
Dessutom kan uppgifter visat här användas med olika stammar, kön och åldrar hos råttor; boende kan dock behöva göras för olika storlekar och i fall av större bräcklighet. Exempelvis äldre, tyngre råttor behöver en bredare stråle för Beam-balans uppgift och äldre, sköra råttor, kan behöver kortare simtur gånger i vattnet labyrint. Således finns det utrymme för flexibilitet i dessa tester och potential för utveckling av nya tester anpassas till olika situationer och hypoteser.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Ian Bolding för hjälp med kirurgisk beredning av försökspersoner och Elizabeth Sumner för hennes noggrann redigering. Dessa studier avslutades som en del av ett team som finansieras av The Moody Project för translationell traumatisk skada hjärnforskning.
Sprague-Dawley rats | Charles Rivers Laboratories 251 Ballardvale St Wilmington, MA 01887-1096 Phone: 800-522-7287 |
CD-IGS rats, strain code 001 | male, albino, 300-350g at arrival |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Balance | |||
Beam | home built | wood, 25" l x 1" h x 3/4" w sealed with polyurethane varnish | |
C-clamp | Home Depot | 1422-C | 2 1/2" |
barrier | Home Depot | styrofoam, 18" x 17 1/2" | |
table (for both BB & BW) | generic office supply | 37" h x 30" w x 60" l | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beam-Walk | |||
Beam | home built | wood 38-1/2" l x 1-3/4" h x 1" w sealed with polyurethane varnish (~ 37" off floor) | |
escape box | home built | woodpainted black 12 1/2 " l x 9" h x 7-1/4" w | |
nails (pegs) | 2" | ||
hinges | |||
clamps | |||
white noise machine | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf | |
light | Home Depot | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Morris Water Maze | |||
fiberglass pool | manufacturer unknown | ||
(similar to one made by SDI) | San Diego Instruments | 7000-0723 | 72" diameter x 30" deep (~ 500 gal) |
plexiglass platform | hand-made by Maggie Parsley | 10 cm diameter, 26" tall with silicone applied to the surface of the platform to provide a gripping surface | |
(similar to one made by SDI) | SDI | 7500-0272 | |
plexiglass animal boxes w/ lids | UTMB Machine Shop | 2 boxes, 10" w x 16" L x 9" h | |
spot lights/ heat lamps | Home Depot | 3 around pool, 2 over boxes to dry animals | |
AnyMaze | San Diego Instruments 9155 Brown Deer Rd, Suite 8 San Diego, CA 92121 Phone: (858)530-2600 |
/9001 | http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/ |