שיטה להעריך אפקטים Bacteriocin על מיקרוביוטה המעיים של עכברים
Summary
Bacteriocins הם האמינו לשחק תפקיד מפתח בהגדרת מגוון חיידקים נישות אקולוגיות שונות. כאן, אנו מתארים הליך יעיל כדי להעריך כיצד bacteriocins להשפיע על ההרכב microbiota המעיים במודל חיה.
Abstract
שאלות מעניינות מאוד מתעוררות עם הידע המתקדם שלנו על הרכב מיקרוביוטה במעיים ועל הקשר עם הבריאות, במיוחד ביחס לגורמים התורמים לשמירה על מאזן האוכלוסייה. עם זאת, יש מתודולוגיות זמין מוגבל להעריך גורמים אלה. Bacteriocins הם פפטידים מיקרוביאלית המיוצרים על ידי חיידקים רבים אשר עשויים להעניק יתרון תחרותי לרכישת מזון ו / או נישה הקמת. הרבה חיידקי חומצה לקטית פרוביוטיים (LAB) יש פוטנציאל גדול לקדם בריאות האדם ובעלי חיים על ידי מניעת צמיחה של פתוגנים. הם יכולים לשמש גם עבור אפנון immuno, כפי שהם מייצרים bacteriocins. עם זאת, פעילות אנטגוניסטית של בקטריוצינים נקבע בדרך כלל על ידי bioassays במעבדה בתנאים מוגדרים אך מופשטים יתר על המידה לעומת הסביבה המעיים מורכבת בבני אדם ובעלי חיים, שבו חיידקים הפנים השפעות multifactorial מן המארח ומאות מיני מינים של מיקרוביאליתניר באותה נישה. עבודה זו מתארת הליך שלם ויעיל להערכת ההשפעה של מגוון של bacteriocins עם ספציפיות מטרה שונים במערכת Murine. שינויים בהרכב microbiota במהלך הטיפול bacteriocin מנוטרים באמצעות רצף 16S rDNA ההלחנה. הגישה שלנו משתמשת הן את המפיקים bacteriocin ואת האיסוגני שלהם שאינם bacteriocin בייצור מוטציות, האחרון נותן את היכולת להבחין בין bacteriocin הקשורות מ שאינם bacteriocin הקשורים שינויים של המיקרוביוטה. מיצוי דנ"א צואה ושיטות רצף 16S rDNA הם עקביים, יחד עם הביואינפורמטיקה, מהווים הליך חזק למצוא שינויים חלשים בפרופילים חיידקים כדי לקבוע מתאמים, במונחים של כולסטרול וריכוז טריגליצרידים, בין אוכלוסיות חיידקים וסמנים בריאותיים. הפרוטוקול שלנו הוא גנרי ולכן יכול לשמש כדי ללמוד תרכובות אחרות או חומרים מזינים עם פוטנציאל לשנות את המיקרופון המארחהרכב robiota, גם כאשר לומדים רעילות או השפעות מועילות.
Introduction
Bacteriocins הם פפטידים אנטי מיקרוביאליים המיוצרים על ידי מגוון רחב של מינים חיידקים 1 , 2 . תרכובות אלו ומפיקים שלהם, במיוחד LAB, נחקרו ומנוצלים ברחבי העולם במשך עשרות שנים עבור יישומים פוטנציאליים שלהם לשימור מזון ותרופות 3. כמה בקטריוצינים ידועים להרוג פתוגנים חשובים, כולל מינים של ליסטריה, אנטרוקוקוס, סטפילוקוקוס, ו Bacillus . חלק bacteriocins אפילו יש את היכולת לווסת את התגובה החיסונית 4 . בקטריוצינים רבים יש ספקטרה צרה יחסית, רכוש זה מוערך הרבה ביישומים מסוימים. לדוגמה, כמה בקטריוצינים צרים-ספקטרום יכולים לשמש כדי לכוון פעילות ספציפית נגד קבוצות נבחרות של חיידקים בעייתיים, ללא הפרעה רבה בצמחייה או בצמחים המועילים החולקים את אותה גומחה; זה חיוני במיוחד באזור המעיים, שבו חיידקים מועילים רבים לשגשג באופן אינטראקטיבי ודינמי 5 . Bacteriocins הם גם מאוד אטרקטיבי לשימוש מניעתי או פרוביוטיקה, כפי שהם יכולים לדכא את (out) הצמיחה של פתוגנים, pathobionts, או חיידקים אופורטוניסטי שעשויים לא מאוזן את המעיים הומאוסטזיס 6 , 7 .
במונחים של טבעם ותכונותיהם הפיזיקוכימיות, הבקטריוצינים מגוונים מאוד, שכן יש להם מבנים שונים, תכונות ספציפיות, דרכי פעולה וכו '. רוב הבקטריוצינים נחקרו בפירוט רב במבחנה , אך מעטים מאוד נבדקו במזון מטריצות 8 , 9 או in vivo, כגון בבטן בעלי חיים 6 , 10 . המאפיינים חוץ גופית יכול להיות שונה במידה רבה כאשר מוערך in vivo בשל המורכבות oF הסביבה המעיים וגם השפעות בלתי רצויות משוערות על חיידקים מועילים. רוב פרוביוטיקה הם LAB. הם מייצרים מערך של מטבוליטים אחרים, כולל חומצות שומן קצרות שרשרת, אשר ידועים להשפיע על הפיזיולוגיה של המארח, כמו גם להפגין תכונות מיקרוביאלית כלפי חיידקים מסוימים. לכן, במקרה של זנים פרוביוטיים המייצרים בקטריוצינים, מומלץ לבסס מבחנים מציאותיים, כגון בעלי חיים בריאים עם מיקרוביוטה רגילה.
במחקר הנוכחי, אנו מספקים אסטרטגיה המאפשרת להעריך את ההשפעה של זנים שונים לייצור בקטריוצין, שבקטריוצינים בעלי ספקטרה מעכבת שונה, על עכברים בריאים. האסטרטגיה שלנו כוללת עכברים להאכיל עם מוטציות isogenic שאינם bacteriocin, אשר מאפשר את ההבחנה של ההשפעות מתווך bacteriocin מן ההשפעות non-bacteriocin בתיווך. רצף 16S rDNA מאפשר לעקוב אחר השינויים הדינמיים של האוכלוסייה חיידקים במעיים. Subsהניתוח הסטטיסטי השווה מפרק את המתאמים בין המינים החיידקיים וגם בין המינים החיידקיים לבין הפרמטרים הפיזיולוגיים הנמדדים ( למשל, משקל הגוף, פרמטרים ביוכימיים בסרום וכד ' ). אנו מאמינים כי הפרוטוקול המוצג במחקר זה הוא גם ישים ליישומים פרוביוטיות או פרביוטיות אחרות מעבר המחקר של bacteriocins בבעלי חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המתואר כאן שימש כדי לקבוע אם השינויים המיקרוביטים קשורים לבריאות או לגיל. חלקים שונים של הפרוטוקול הם חשובים, אבל ביניהם, דגימה של הצואה, בחירת קטע ה- DNA להיות רצף וניתח, וביצוע מיצוי ה- DNA וניתוח ביואינפורמאטי בהחלט יכול להיות נקודות קריטיות ביותר. הדגימה היא קרי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ל- EEA Grant NILS Science and Sustainability ניידות מתואמת של חוקרים (הפניה 017-ABEL-CM-2013). CB ו- GP-M. נתמכו על ידי מענק AGL2015-70487-P ממשרד הכלכלה והתחרות הספרדי. OCOU ו DBD נתמכו על ידי תוכנית מלגה אסטרטגית למחקר מדעי המזון מן האוניברסיטה הנורבגית של מדעי החיים (NMBU) (פרויקט 1205051025). ברצוננו להודות Inmaculada Noguera על עזרתה עם טיפול בבעלי חיים ודגימה ישו Dehesa על עזרתו עם הבטחת הזמינות של חומרי מעבדה במתקן החיות. אנו מעריכים גם את פרופ 'לארס-גוסטב סניפן על עצתו על הסטטיסטיקה.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
Referências
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. . Advances in Applied Microbiology. 54, 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?. Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, &. #. 2. 1. 4. ;. C. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 – Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
