Bakteriyosin Etkilerini Farenin Bağırsak Mikrobiyolojisi Üzerine Etkileyen Bir Yöntem
Summary
Bakteriyosinlerin farklı ekolojik alanlarda mikrobik çeşitliliği tanımlamada önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Burada, bir hayvan modelinde bakteriyosinin bağırsak mikrobiyotik kompozisyonunu nasıl etkilediğini değerlendiren etkili bir prosedürü anlatacağız.
Abstract
Bağırsak mikrobiyoteri bileşimi ve sağlıkla olan ilişkisi, özellikle de nüfus dengesinin korunmasına katkıda bulunan faktörlerle ilgili gelişen bilgilerimiz ile ilginç sorular ortaya çıkıyor. Bununla birlikte, bu faktörleri değerlendirmek için sınırlı metodoloji bulunmaktadır. Bakteriyosinler, gıda bakımı ve / veya niş oluşumu için rekabet avantajı sağlayabilecek birçok bakteri tarafından üretilen antimikrobiyal peptitlerdir. Birçok probiyotik laktik asit bakteri (LAB) suşu patojenlerin büyümesini önleyerek insan ve hayvan sağlığını geliştirme potansiyeline sahiptir. Bakteriyosinler ürettikleri için immüno modülasyon için de kullanılabilirler. Bununla birlikte, bakteriyosinlerin antagonistik aktivitesi, normal olarak, tanımlanmış fakat aşırı basitleştirilmiş koşullar altında, bakterilerin konakçıdan ve yüzlerce mikrobik türden çok faktörlü etkilere maruz kaldığı insanlardaki ve hayvanlardaki karmaşık bağırsak ortamıyla karşılaştırıldığında laboratuar biyolojik tahlilleri ile saptanırAynı niş haring. Bu çalışma, etkiyi değerlendirmek için eksiksiz ve etkili bir prosedürü tanımlamaktadır. Bir sıçangil sisteminde farklı hedef spesifıkliklere sahip çeşitli bakteriosinler. Bakteriyosin muamelesi esnasında mikrobiyotik bileşimdeki değişiklikler, bileşimsel 16S rDNA dizilimi kullanılarak izlenir. Yaklaşımımız hem bakteriosin üreticilerini hem de izojenik olmayan bakteriyosin üreten mutantları kullanmaktadır; bu mutantlar, bakteriyosin ile ilişkili mikrobiyota ait olmayan bakteriyosin ile ilgili değişiklikleri ayırt etme yeteneği vermektedir. Dışkı DNA ekstraksiyonu ve 16S rDNA sekanslama yöntemleri tutarlıdır ve biyoinformatik ile birlikte bakteriyel profillerde hafif değişiklikler bulmak ve bakteri popülasyonları ile sağlık markörleri arasındaki kolesterol ve trigliserid konsantrasyonu açısından korelasyonlar oluşturmak için güçlü bir prosedür oluşturmaktadır. Protokolümüz jeneriktir ve bu nedenle, ana mikrofonu değiştirme potansiyeline sahip diğer bileşikleri veya besleyicileri incelemek için kullanılabilirRobiota kompozisyonu, ya toksisite ya da yararlı etkiler çalışılırken.
Introduction
Bakteriyosinler, geniş bir bakteri türü 1 , 2 tarafından üretilen antimikrobiyal peptidlerdir. Bu bileşikler ve üreticileri, özellikle LAB, yıllardır gıda koruma ve tıbbında potansiyel uygulamaları için dünya çapında araştırılmış ve istismar edilmiştir 3 . Birkaç bakteriosin, Listeria, Enterococcus, Staphylococcus ve Bacillus türlerini içeren önemli patojenleri öldürdüğü bilinmektedir. Bazı bakteriyosinler bile bağışıklık tepkisini 4 modüle etme yeteneğine sahiptirler. Pek çok bakteriyosinin nispeten dar spektrumları vardır, bu özellik bazı uygulamalarda çokça takdir edilmektedir. Örneğin, bazı dar spektrumlu bakteriosinler, aynı nişin paylaşımında bulunan komensal veya faydalı bitki üzerinde çok fazla rahatsızlık olmaksızın seçilen sorunlu bakteri gruplarına karşı spesifik aktiviteyi yönlendirmek için kullanılabilir; Bağırsak envirinde bu özellikle önemlidirSayısız faydalı mikropların etkileşimli ve dinamik bir şekilde yetiştiği 5 . Bakteriyosinler, bağırsak homeostazını dengesiz hale getirecek patojenler, patobiyonlar veya fırsatçı bakterilerin büyümesini bastırabildikleri için profilaktik veya probiyotik kullanım için çok caziptirler 6 , 7 .
Bakteriyosinler, doğaları ve fizikokimyasal özellikleri açısından farklı yapılara, hedef spesifitelerine, hareket şekillerine vb sahip oldukları için çok çeşitlidirler . Çoğu bakteriyosin, in vitro ortamlarda çok detaylı olarak incelenmiştir, ancak çok az gıda test edilmiştir Matrisler 8 , 9 ya da bir hayvansal bağırsak 6 , 10 gibi in vivo . In vitro özellikler, in vivo değerlendirildiğinde büyük ölçüde farklılık gösterebilir;Bağırsak ortamı ve yararlı bakteriler üzerinde istenmeyen etkiler. En probiyotikler LAB'dir. Kısa zincirli yağ asitleri de dahil olmak üzere konağın fizyolojisini etkilediği bilinen bazı bakterilere karşı antimikrobiyal özelliklerin sergilendiği diğer metabolitleri üretirler. Bu nedenle, bakteriyosinler üreten probiyotik suşlar söz konusu olduğunda, normal mikrobiyota sahip sağlıklı hayvanlar gibi gerçekçi testler yapmak en iyisidir.
Bu çalışmada, bakteriyosinler farklı inhibisyon spektrumlarına sahip olan farklı bakteriyosin üreten suşların sağlıklı farelerde etkisinin değerlendirilmesini sağlayan bir strateji sunuyoruz. Stratejimiz, bakteriyosin aracılı etkilerin bakteriyosin aracılı etkilerden farklılaşmasını sağlayan izogenik bakteriyosin olmayan mutantları farelere beslemeyi içerir. Dizilim 16S rDNA, bağırsaktaki bakteri popülasyonunun dinamik değişikliklerini izlemeyi sağlar. SubsDengi istatistiksel analiz, bakteriyel türler arasında ve ayrıca bakteri türleri ile ölçülen fizyolojik parametreler ( örn. Vücut ağırlığı, serum biyokimyasal parametreleri, vb. ) Arasındaki korelasyonları deşifre eder. Bu çalışmada sunulan protokolün canlı hayvanlardaki bakteriosinler üzerinde yapılan diğer probiyotik veya prebiyotik uygulamalar için de geçerli olduğuna inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan prosedür, mikrobiyotik değişikliklerin sağlık veya yaşa bağlı olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Protokolün farklı kısımları önemlidir, ancak bunların arasında örnekleme, dizilenip analiz edilecek DNA parçasının seçimi ve DNA özütleme ve biyoinformatik analiz yapılması kesinlikle kritik noktalardır. Örnekleme önemlidir, çünkü etik nedenlerden ötürü farelere vurgu yapılmamalı ve bağırsaktaki bakteri oranını değiştirdiği bilinmektedir. Baz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, AEA Grant NILS Bilim ve Sürdürülebilirlik Koordinasyonlu Araştırmacılar Hareketliliğine (referans 017-ABEL-CM-2013) teşekkür etmek istiyorlar. CB ve GP-M. İspanya Ekonomi ve Rekabetçilik Bakanlığı'ndan AGL2015-70487-P hibe ile desteklendi. OCOU ve DBD Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi (NMBU) gıda bilim araştırması için stratejik bir burs programı tarafından desteklendi (proje 1205051025). Hayvan bakımında ve örneklemeyle ilgili yardımıyla Inmaculada Noguera'ya ve hayvan tesisindeki laboratuar malzemelerinin bulunabilirliğini sağlamak için yaptığı İsa Dehesa'ya da teşekkür ederiz. Profesör Lars-Gustav Snipen'e istatistik konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
Referências
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. . Advances in Applied Microbiology. 54, 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?. Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, &. #. 2. 1. 4. ;. C. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 – Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
