Een methode om bacterie-cineffecten op de Gut Microbiota van Muizen te beoordelen
Summary
Bacteriocinen zijn van mening dat ze een sleutelrol spelen bij het definiëren van microbiële diversiteit in verschillende ecologische niches. Hier beschrijven we een efficiënte procedure om te beoordelen hoe bacteriocinen invloed hebben op de darmmicrobiota samenstelling in een diermodel.
Abstract
Zeer intrigerende vragen ontstaan door onze vooruitgangskennis over de microbiota samenstelling van de darm en de relatie met de gezondheid, met name met betrekking tot de factoren die bijdragen tot het behoud van het bevolkingsbalans. Er zijn echter beperkte beschikbare methodologieën om deze factoren te evalueren. Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door vele bacteriën die een concurrentievoordeel voor voedselverwerving en / of niche-vestiging kunnen veroorzaken. Veel probiotische melkzuurbacteriën (LAB) stammen hebben een groot potentieel om de gezondheid van mens en dier te bevorderen door de groei van pathogenen te voorkomen. Ze kunnen ook gebruikt worden voor immunomodulatie, omdat ze bacteriocinen produceren. Echter, de antagonistische activiteit van bacteriocinen wordt normaal gesproken bepaald door laboratorium bioassays onder goed gedefinieerde maar over vereenvoudigde condities in vergelijking met de complexe darmomgeving bij mensen en dieren, waar bacteriën multifactoriale invloeden uit de gastheer en honderden microbiële soorten s hebbenDezelfde niche hebben. Dit werk beschrijft een volledige en efficiënte procedure om het effect te beoordelen Van een verscheidenheid aan bacteriocinen met verschillende doelspecificiteiten in een muizenstelsel. Veranderingen in de microbiota samenstelling tijdens de bacteriocine behandeling worden gecontroleerd met behulp van composities 16S rDNA sequencing. Onze aanpak maakt gebruik van zowel de bacteriocinproducenten als hun isogene, niet-bacteriocine-producerende mutanten, waarbij de laatstgenoemde het vermogen geeft om bacteriocine-gerelateerd te maken van niet-bacteriocinverwante modificaties van de microbiota. De fecale DNA-extractie en 16S rDNA sequencing methoden zijn consistent en vormen samen met de bioinformatica een krachtige procedure om zwakke veranderingen in de bacteriële profielen te vinden en om correlaties te bepalen in termen van cholesterol en triglyceride concentratie tussen bacteriepopulaties en gezondheidsmarkers. Ons protocol is generisch en kan dus gebruikt worden om andere verbindingen of voedingsstoffen te bestuderen met de mogelijkheid om de gastheermicro te veranderenRobiota samenstelling, hetzij bij het bestuderen van toxiciteit of gunstige effecten.
Introduction
Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door een breed scala van bacteriële species 1 , 2 . Deze verbindingen en hun producenten, met name LAB, zijn al decennia wereldwijd verkend en geëxploiteerd voor hun mogelijke toepassingen in voedselbehoud en medicijnen 3 . Verschillende bacteriocinen zijn bekend om belangrijke pathogenen te doden, waaronder soorten Listeria, Enterococcus, Staphylococcus pt Bacillus . Sommige bacteriocinen hebben zelfs de mogelijkheid om de immuunrespons 4 te moduleren. Veel bacteriocinen hebben relatief smalle spectra, een eigenschap die in sommige toepassingen zeer gewaardeerd wordt. Bijvoorbeeld, sommige smal spectrum bacteriocinen kunnen worden gebruikt om specifieke activiteit te richten tegen geselecteerde groepen van problematische bacteriën, zonder veel storing op de commensale of voordelige flora die dezelfde niche delen; Dit is vooral essentieel in de gut envirOnment, waar talrijke gunstige microben op interactieve en dynamische wijze gedijen 5 . Bacteriocinen zijn ook zeer aantrekkelijk voor profylactisch of probiotisch gebruik, omdat ze de (uit) groei van pathogenen, pathobionten of opportunistische bacteriën kunnen onderdrukken die de darmhomeostase 6 , 7 kunnen onevenwichtigen.
In termen van hun aard en fysisch-chemische eigenschappen zijn bacteriocinen zeer divers, omdat ze verschillende structuren, doelspecificiteiten, werkingsmethoden, enz. Hebben . De meeste bacteriocinen zijn in detail in de in vitro- instellingen bestudeerd, maar zeer weinig zijn in voedsel getest Matrices 8 , 9 of in vivo, zoals in een darmdarm 6 , 10 . De in vitro eigenschappen kunnen in grote mate verschillen wanneer ze in vivo worden beoordeeld door de complexiteit oF de darmomgeving en ook aan vermoedelijke onbedoelde effecten op gunstige bacteriën. De meeste probiotica zijn LAB. Ze produceren een scala aan andere metabolieten, waaronder korte keten vetzuren, die bekend zijn om de fysiologie van de gastheer te beïnvloeden, evenals antimicrobiële eigenschappen aan te tonen tegen bepaalde bacteriën. Daarom, in het geval van probiotische stammen die bacteriocinen produceren, is het het beste om realistische analyses vast te leggen, zoals gezonde dieren met normale microbiota.
In de huidige studie bieden we een strategie die het mogelijk maakt om het effect van verschillende bacteriocine-producerende stammen te beoordelen, waarvan bacteriocinen verschillende remmende spectra hebben op gezonde muizen. Onze strategie omvat het voeden van muizen met isogene niet-bacteriocin mutanten, die de differentiatie van bacteriocine-gemedieerde effecten mogelijk maken van niet-bacteriocine gemedieerde effecten. Sequencing 16S rDNA maakt het mogelijk om de dynamische veranderingen van de bacteriële populatie in de darm te volgen. SubsEquivalent statistische analyse deciphers correlaties tussen bacteriële soorten en ook tussen bacteriële soorten en gemeten fysiologische parameters ( bijvoorbeeld lichaamsgewicht, serum biochemische parameters, enz. ). Wij geloven dat het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, ook van toepassing is op andere probiotische of prebiotische toepassingen buiten de studie van bacteriocinen bij levende dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedure is gebruikt om te bepalen of veranderingen in de microbiota gebonden zijn aan gezondheid of leeftijd. Verschillende delen van het protocol zijn belangrijk, maar onder hen kunnen de ontlasting, het selecteren van het DNA-fragment dat wordt gedetecteerd en geanalyseerd, en het uitvoeren van de DNA-extractie en bioinformatische analyse zeker de meest kritische punten zijn. Bemonstering is cruciaal omdat muizen om ethische redenen niet moeten worden gestresseerd en omdat het bekend is dat het aa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de EER Grant NILS Coordinated Mobility of Researchers (Referentie 017-ABEL-CM-2013) bedanken voor wetenschap en duurzaamheid. CB en GP-M. Werden ondersteund door de subsidie AGL2015-70487-P van het Spaanse ministerie van Economie en Concurrentievermogen. OCOU en DBD werden ondersteund door een strategisch beurs programma voor voedselwetenschappelijk onderzoek van de Noorse Université of Life Sciences (NMBU) (project 1205051025). We willen ook Inmaculada Noguera bedanken voor haar hulp bij dierenverzorging en bemonstering en Jezus Dehesa voor zijn hulp om de beschikbaarheid van laboratoriummateriaal in de dierenfaciliteit te waarborgen. We waarderen ook professor Lars-Gustav Snipen voor zijn advies over statistieken.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
Referências
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. . Advances in Applied Microbiology. 54, 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?. Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, &. #. 2. 1. 4. ;. C. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 – Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
