Method Article

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

DOI:

10.3791/56061

⸱

December 6th, 2017

 ,  , 
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para descoberta de reagente de afinidade de peptídeo para reconhecimento de alvos bióticos e abióticos. Reagentes de afinidade de peptídeo podem ser usados para aplicações semelhantes a anticorpos, incluindo detecção e terapêutica, mas são mais robustos e capazes de executar em ambientes mais extremos. Enriquecimento específico dos agentes de captura do peptide para um alvo da proteína de interesse é realçado usando métodos de triagem semi-automático que melhoram a vinculação e lavagem as etapas e, portanto, diminuem a ocorrência de falsos positivos aglomerantes. Um método de classificação semi-automático é descrito neste documento para uso com uma comercial automatizada magnético-ativado célula classificação dispositivo com um display bacteriano irrestrito classificação biblioteca expressando 15-mer aleatória de peptídeos. Com pequenas modificações, estes métodos são extensíveis a outros dispositivos, outras bibliotecas de classificação e outros organismos automatizados. Um objetivo principal deste trabalho é fornecer uma metodologia abrangente e expor o processo de pensamento aplicado na análise e minimizando a piscina resultante dos candidatos. Estas técnicas incluem análise de vinculação na célula usando fluorescência-ativado da pilha (FACS), de classificação para avaliar a afinidade e especificidade durante classificando e comparando os candidatos individuais, e a análise de peptídeo sequências para identificar tendências e sequências de consenso para compreender e melhorar potencialmente a afinidade de e especificidade para o alvo de interesse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopanning é uma técnica comprovada para a descoberta do reagente de afinidade, com bacteriano exibir bibliotecas uma fonte conveniente para peptídeo afinidade reagentes 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Da mesma forma para fago 25,26 e levedura exposição 27,28, os peptídeos são expostos na superfície das células e estão disponíveis para vincular a alvos bióticos e abióticos, com essas interações guiado por tanto a espinha dorsal do peptide e as propriedades únicas de cadeias laterais de aminoácidos 29. Em contraste com a exibição do fago, as bactérias se são auto-replicantes e contêm todo o material genético necessário para a exibir sem eluição do fago encadernado e reinfecção das células. Em contraste com a exibição de levedura, visor bacteriana é mais rápido devido a rápida (aproximadamente 20 min 30) tempo de Escherichia colide duplicação. Os reagentes de afinidade de peptídeo resultante podem ser produzidos fora de células para uso em uma variedade de plataformas 16,17,26 de sensoriamento e têm potencial para uso como materiais vivos quando exibido na célula- 2 , 31 , 32. em comparação com os anticorpos monoclonais para reconhecimento de metas específicas, peptídeos são muito menores e mais flexíveis, e bibliotecas de exibição de peptídeo podem ser facilmente manipuladas no nível do DNA, para evitar a aminoácidos específicos, como a cisteína 33 . Peptídeos são cada vez mais explorados para terapêutica 34,35,36 e outras aplicações onde anticorpos normalmente iria ser utilizados devido a sua facilidade de descoberta, reprodutível sintético (fora-célula ), produção e manutenção superior de desempenho em ambientes extremos, proporcionando um reagente funcional mesmo após exposição à alta temperatura ou armazenamento a longo prazo sem refrigeração 37,38. A capacidade de superar a cadeia de frio para armazenamento de reagentes é de particular interesse para o departamento de defesa, por exemplo, que deve operar em ambientes extremos. Estabilidade térmica, portanto, era uma característica desejável para os reagentes de afinidade, reconhecendo os alvos escolhidos dados como exemplos neste manuscrito.

Recentemente, biopanning bacteriana exibir bibliotecas tornou-se ainda mais simples e confiável com o uso de semi-automatizadas magnético-ativado da pilha (MACS ou MCS) métodos 9,14,39de classificação. Esses métodos foram demonstrados para alvos biológicos usando vários semelhantes plataformas com vantagens diferentes, incluindo um comercialmente disponível de classificação automatizada magnético-ativado da pilha (autoMACS ou autoMCS) instrumento de classificação (ver tabela de materiais) 1,14,15 e dispositivos mais especializados que coloque a amostra em um cartucho descartável 7,9 ou chip 39, uma valiosa especificação para usam com organismos ou toxinas que são nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou superior7. Esses métodos semi-automático poderiam ser estendidos para classificar por peptídeos capazes de unir materiais abióticos se os materiais são magnéticos ou têm a capacidade de ser revestido em uma esfera magnética e para uso com diferentes organismos (por exemplo, bactérias anaeróbias) se a classificação e condições de crescimento são alteradas. Além de classificação bacteriana exibir bibliotecas, o instrumento de autoMCS comercial usado aqui também tem sido utilizado em parte para os passos iniciais da descoberta de fragmentos de anticorpos de cadeia única humana exibida na superfície da levedura, seguida pelo isolamento adicional usando fluorescente ativado celular classificação (FACS) 40. As principais vantagens de automação semi decrescem classificação tempo e esforço e mais robusta e reprodutível eliminação de pilhas unbound de grânulos magnéticos durante as etapas de lavagem, levando à redução de falsos positivos, menos rodadas classificação necessárias e menos análise de jusante complicado 9,14. No caso do instrumento de autoMCS comercial, existem vários programas pré-instalados que podem ser ideais para aplicações diferentes, como negativo pré-triagem (depleção), priorizando a pureza, minimizando o volume de amostra final e aumentando ou diminuindo a sensibilidade para o isolamento de células raras 41.

O foco deste trabalho é demonstrar a metodologia para biopanning uma biblioteca de exibição bacteriana usando o instrumento de autoMCS disponíveis comercialmente e para expor o processo de pensamento aplicado na análise e minimizando a piscina resultante dos candidatos em fim de facilitar a extensão para outras aplicações. A biblioteca de exibição usada aqui (veja a tabela de materiais) 12,13 contém aproximadamente 109- 1011 15-mer exclusivo peptídeos exibidos através de uma versão modificada da proteína da membrana externa bacteriana OmpX em um natureza irrestrita na superfície da célula, que é esperada para ser o representante do peptide livre em solução, se produzido sinteticamente. Este andaime de proteína, além disso, contém um peptídeo de controlo positivo P2X no C-terminal para monitoramento de expressão através da ligação a YPet Mona. No entanto, uma biblioteca comprada ou romance com diversidade adequada e outras características necessárias para o aplicativo específico desejado deve funcionar da mesma forma com este procedimento biopanning, apesar de algumas pequenas mudanças podem ser necessárias. Um esquema do presente protocolo biopanning é ilustrado na Figura 1. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para outro automatizado plataformas classificação magnéticas e outras estratégias de classificação. Classificação magnética manual com um ímã de bancada tem sido demonstrado com sucesso, embora com mais complicado e demorado a jusante análise necessária devido a aumento de falsos positivos 14e, no entanto, fornece uma opção alternativa para o autoMCS passos se nenhuma célula magnética automatizada classificação dispositivo está disponível.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biopanning bacteriana Display usando bibliotecas autoMCS

Nota: Este protocolo de classificação baseado em autoMCS tem sido descrito anteriormente 14, e uma mais profunda "expandido protocolo para novos usuários" está disponível nos materiais complementares para este manuscrito para mais detalhes, incluindo uma explicação do potencial modificações. Se um dispositivo de autoMCS não está disponível para a classificação, consulte o protocolo suplementar de Sarkes et al . 2015 desde um manual de classificação protocolo também é descrito em que trabalho 14. O protocolo de autoMCS desde que aqui tem sido adaptado para incluir etapas adicionais de classificação negativas por especificidade melhorada 1,15. Um esquema do presente protocolo biopanning é ilustrado na Figura 1.

  1. Negativa de triagem para remover ligantes prováveis que reagem de forma cruzada com grânulos magnéticos
    1. Inocular a 500 mL de caldo de Luria Miller (LB) contendo apropriado antibiótico com aproximadamente 1 x 1011células de uma diversificada bacteriano exibem biblioteca classificação (ver tabela de materiais).
      Nota: A exposição bacteriana peptídeo biblioteca usada aqui (veja a tabela de materiais) contém aproximadamente 109- 1011exclusivo membros 8,12 e é cultivado em LB contendo 25 cloranfenicol µ g/mL (LB Cm25). O restante deste protocolo irá assumir que esta biblioteca é usada.
    2. Incubar a 37 ° C com agitação a 225 RPM até que a cultura atinja uma OD600 de 0,5 - 0,55. Induzir a expressão de peptídeos com 0,04% w/v L-arabinose diluindo um 4% das ações 1: 100, sacudindo a 225 RPM por 45 min a 37 ° C.
    3. Lugar induzida por cultura no gelo. Centrifugue a cerca de 2 x 1011 células a 6000 x g por 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1,5 mL de PBS e agitando suavemente.
      Nota: Uma OD600 de 1.0 aproximadamente igual a 1 x 109 células/mL de Escherichia coli.
      Nota: fazer não VORTEX como este podem lisar as células; Resuspenda à mão ou por agitação brevemente a ≤ 225 RPM, 4° C.
    4. Transferência de células para tubos microcentrifuga e girar a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4 ° C. Remova o sobrenadante. Ressuspender as células em solução salina tamponada fosfato 1 mL (PBS) contendo 0,5% albumina de soro bovino (BSA; PBS-B).
    5. Lave 300 µ l de grânulos streptavidin-revestido (cerca de 3 x 109 grânulos, consulte tabela de materiais) em 1 mL de PBS-B e centrifugar por 5 min em ≥ 5, 000g x (na RT). Colocar o tubo em um separador de partículas magnéticas superior do banco. Remova cuidadosamente o sobrenadante, evitando a pelota.
    6. Resuspenda as contas do celular, além disso, mistura de PBS-B preparado acima. Incube a 4° C em uma plataforma giratória para amostras de lugar de 45 min. no gelo.
    7. Ligue o instrumento de autoMCS para inicializar o sistema. Prime linhas usando executar do fabricante e buffers de lavagem (veja a tabela de materiais), selecionando "Lavagem agora" na parte inferior da tela no menu de "Separação", em seguida, "Enxaguar" e "Executar".
    8. Encha o sistema com PBS-B, usando PBS-B como tampão de lavagem e Buffer correndo nas próximas etapas. Selecione o menu "Separação" na barra de navegação superior e "Lavagem agora". Selecione "Enxaguar" e "Correr" para encha o sistema com PBS fresco-B.
    9. Transferi a mistura celular e o grânulo da etapa de incubação para um tubo cônico de 15 mL. Coloque este tubo no slot da amostra e esvaziar os tubos cônico de 15 mL nos slots de seleção positiva e negativa, de uma cremalheira de pre-refrigerados (4 ° C) (ver tabela de materiais). Coloque o Carré na plataforma do instrumento.
    10. Atribuir um programa de separação para cada amostra na prateleira (até 5 amostras pode ser classificado em uma corrida). Adicione uma etapa de "Enxaguar" entre cada amostra e após a última amostra. Selecione "Executar" para iniciar a separação de célula. Selecione "Okey" para confirmar que a reserva suficiente está disponível.
      Nota: O programa de separação de "Posselds" funciona bem para classificação negativa e positiva de classificação 1º round e "Posseld" é o preferido para classificação rodadas 2-4, mas ambos estes programas têm sido utilizados com sucesso para todos os negativos e positivos classificação rodadas 14 ,15 e outros programas podem provar melhores para um aplicativo específico (descrito mais discussão).
    11. Quando o programa estiver concluído, retire o cesto e reter a fração apropriada. Aqui, por uma espécie de negativa, reter frações negativas (contendo células sem grânulos). Coloque no gelo.
    12. Use a fração de classificação negativa na sua totalidade para inocular 1L de LB Cm25 com 0,2% m/v D-glicose. Cresce durante a noite a 37 ° C, agitando a 225 RPM.
    13. Antes de desligar o instrumento autoMCS, altere os buffers de execução e lave para execução do fabricante e buffers de lavagem (veja a tabela de materiais). Selecione "Lavar agora", então "Enxaguar" e "Executar". Quando terminar, certifique-se de que há 70% de etanol na linha de descontaminação, em seguida, pressione o ícone de"energia" no canto superior direito da tela e selecione "Sim".
    14. Quando o desligamento do sistema está completo (as garrafas será roxas), desligar a máquina.
    15. No dia seguinte, use a cultura durante a noite para fazer estoques de congelador com cerca de 1 x 1011células por frasco em LB com 15% de glicerol. Além disso, ou, alternativamente, use esta cultura na próxima etapa: classificação negativa adicional (seção 1.2) ou a primeira rodada de classificação positiva (seção 1.3).
  2. Negativa de triagem para remover ligantes susceptíveis de reação cruzada com outros destinos turísticos
    Nota: A secção 1.2 pode ser ignorada se não ainda mais a classificação negativa é necessário ou desejado. Nesse caso, vá para a seção 1.3. Ligação residual para quaisquer alvos indesejados pode ser avaliada pela FACS como secção 2: FACS análise das rodadas de classificação.
    1. Para classificação negativa contra um alvo de proteínas específicas, tais como uma proteína semelhante com potencial para bind também para a descoberta de peptídeos 1,15, repita os passos de crescimento e indução 1.1.1 - 1.1.3, começando com um estoque congelado de streptavidin-esgotada a biblioteca de passo 1.1.15 ou a cultura da noite da etapa 1.1.12 (usando OD600 para estimar e inocular com células de 1 x 10,11 ).
    2. Transferência de células para tubos microcentrifuga e girar a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4 ° C. Remova o sobrenadante. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS contendo 600 alvo de proteína cross-reactive nM biotinilado. Incube a 4 ° C por 45 min em uma plataforma giratória.
      Nota: 600 nM é uma concentração inicial sugerida, que pode ser alterada se for observada uma vantagem notável. Biotinylation do alvo da proteína pode ser alcançado e quantificados usar os reagentes sugerido na tabela de materiais.
    3. Enquanto isso, lave 100 µ l de streptavidin-revestido grânulos (cerca de 1 x 109 ) em 1 mL de PBS-B e centrifugar por 5 min a ≥ 5.000 x g (na RT). Colocar o tubo em um separador de partículas magnéticas superior do banco e cuidadosamente remover sobrenadante, evitando a pelota.
    4. Centrifugar as células alvo ligados a 6.000 x g por 5 min (RT ou 4° C), remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS-B. Resuspenda grânulos em todo volume de lavado células ligado ao destino de proteína cross-reactive. Incube a 4° C em uma plataforma giratória por 30 min.
    5. Colocar a amostra em gelo e etapas completas 1.1.7 - 1.1.15 para uma espécie de negativa, fazendo ações apropriadas do congelador. Continue a secção 1.3 para um tipo positivo se todas classificação negativa desejado foi alcançado, ou repetir a secção 1.2 a espécie negativa contra outra proteína cross-reactive potencial.
  3. Rodada 1 tipo positivo
    Nota: Round 1 classificação positiva contra uma proteína específica alvo é semelhante a uma classificação negativa contra um alvo específico de classificação (ver 1.2), exceto que a fração do grânulo-contendo, positiva é retida.
    1. Inocular a 500 mL de LB Cm25 com aproximadamente 1 x 1011células de uma diversificada bacteriano exibir biblioteca classificação que foi empobrecido streptavidin e crescido durante a noite (da etapa 1.1.12) ou congelado (da etapa 1.1.15) e descongeladas no gelo, ou que tenha sido mais empobrecido de aglomerantes para outros alvos da proteína cross-reactive (da etapa 1.2.5), como desejado.
    2. Incubar a 37 ° C com agitação a 225 RPM até que a cultura atinja uma OD600 de 0,5 - 0,55. Induzir a expressão de peptídeos com 0,04% w/v L-arabinose diluindo um 4% das ações 1: 100, sacudindo a 225 RPM por 45 min a 37 ° C.
    3. Lugar induzida por cultura no gelo. Centrifugue a cerca de 2 x 1011 células a 6.000 x g por 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1,5 mL de PBS e agitando suavemente (manualmente ou por agitação brevemente a ≤ 225 RPM, 4° C).
    4. Transferência de células para tubos microcentrifuga e girar a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4 ° C. Remova o sobrenadante.
    5. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS contendo 600 nM biotinilado proteína alvo interesse. Incube a 4 ° C por 45 min em uma plataforma giratória.
      Nota: 600 nM é uma concentração inicial sugerida, que pode ser alterada se for observada uma vantagem notável. Biotinylation do alvo da proteína pode ser alcançado e quantificados usar os reagentes sugerido na tabela de materiais.
    6. Enquanto isso, lave 100 µ l de streptavidin-revestido grânulos (cerca de 1 x 109 ) em 1 mL de PBS-B e centrifugar por 5 min a ≥ 5.000 x g (na RT). Colocar o tubo em um separador de partículas magnéticas superior do banco e remova cuidadosamente o sobrenadante, evitando a pelota.
    7. Quando a incubação com destino estiver concluída, Centrifugar as células alvo ligados a 6.000 x g por 5 min (RT ou 4° C) para remover qualquer proteína alvo desacoplado. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS-B. Resuspenda grânulos em todo volume de lavado células ligado ao destino de proteína. Incube a 4° C em uma plataforma giratória de 30 min. lugar no gelo.
    8. Ligue o instrumento de autoMCS para inicializar o sistema. Prime linhas usando executar do fabricante e buffers de lavagem (veja a tabela de materiais), selecionando "Lavagem agora" na parte inferior da tela no menu de separação, em seguida, "Enxaguar" e "Executar".
    9. Encha o sistema com PBS-B, usando PBS-B como tampão de lavagem e Buffer correndo nas próximas etapas. Selecione o menu de separação na barra de navegação superior e lavagem agora. Selecione enxaguar e gerência para encha o sistema com PBS fresco-B.
    10. Transferi a mistura celular e talão de etapa de incubação acima para um tubo cônico de 15 mL, enxaguar o tubo com um adicional 500 µ l de PBS-B e pool a lavagem com a amostra. Coloque este tubo no slot da amostra e esvaziar os tubos cônico de 15 mL nos slots de seleção positiva e negativa, de uma cremalheira de pre-refrigerados (4 ° C) (ver tabela de materiais). Coloque o Carré na plataforma do instrumento.
    11. Atribuir um programa de separação para cada amostra na prateleira (até 5 amostras pode ser classificado em uma corrida). Adicione uma etapa de "Enxaguar" entre cada amostra e após a última amostra. Selecione "Executar" para iniciar a separação de célula. Selecione "Okey" ou "Continuar" para confirmar que a reserva suficiente está disponível.
      Nota: O programa de separação de "Posselds" funciona bem para classificação negativa e positiva de classificação rodada 1 e "Posseld" é o preferido para classificação rodadas 2-4, mas ambos estes programas têm sido utilizados com sucesso para todos os negativos e positivos classificação rodadas 14 , 15 e outros programas podem provar melhores para um aplicativo específico (descrito mais discussão).
    12. Quando o programa estiver concluído, retire o cesto e reter a fração apropriada. Aqui, para um tipo positivo, reter frações positivas (contendo células e grânulos). Coloque no gelo.
    13. Antes de desligar o instrumento autoMCS, altere os buffers de execução e lave para execução do fabricante e buffers de lavagem (veja a tabela de materiais). Selecione "Lavar agora", então "Enxaguar" e "Executar". Quando terminar, certifique-se de que há 70% de etanol na linha de descontaminação, em seguida, pressione o ícone de"energia" no canto superior direito da tela e selecione "Sim".
    14. Quando o desligamento do sistema está completo (as garrafas será roxas), desligar a máquina.
    15. Use a fração de tipo positivo na sua totalidade para inocular 1L de LB Cm25 com 0,2% m/v D-glicose. Cresce durante a noite a 37 ° C, agitando a 225 RPM.
    16. No dia seguinte, usar a cultura durante a noite para fazer estoques de congelador em LB contendo 15% de glicerol e/ou continuar a positivo classificação rodada 2 na secção 1.4.
  4. Rondas subsequentes de triagem positivas
    Nota: Normalmente, quatro rodadas de classificação são recomendadas, embora três rodadas de classificação são geralmente suficientes 14,15. Quando parar de classificação é assistido por FACS análise das rodadas de classificação descrito na secção 2. Concentrações de alvo e volume do grânulo magnético diminuem com cada rodada subsequente de classificação positiva.
    1. Usando a cultura durante a noite de rodada classificação anterior (ou um estoque de células congeladas de assalto), inocular 5ml LB Cm25 com 100 µ l de células (01:50 diluição). Incubar a 37° C com agitação a 225 RPM até que a cultura atinja uma OD600 de 0,5 - 0,55.
    2. Induzir a expressão de peptídeos com 0,04% w/v L-arabinose, sacudindo a 225 RPM por 45 min a 37° C. Lugar induzida por células no gelo.
      Nota: Esta cultura induzida também pode ser usada para avaliar a afinidade de ligação e especificidade para a rodada de classificação que originou-se, conforme descrito na seção 2 abaixo.
    3. Centrifugar 1 x 108 células a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 50 µ l PBS contendo metade da concentração de biotinilado alvo de proteína de interesse, usado para a rodada anterior de classificação (portanto 300 nM da rodada 2, 150 nM para a rodada 3 e 75 nM para rodada 4 de nossos sugerido ponto de partida). Incube durante 45 min no gelo (ou a 4 ° C, uma plataforma giratória).
    4. Enquanto isso, lave grânulos streptavidin-revestido (15 µ l para o round 2, 8 µ l para a rodada 3 e 4 µ l para o round 4) em 1 mL de PBS-B e centrifugar durante 5 min à ≥ 5.000 x g (na RT). Colocar o tubo em um separador de partículas magnéticas superior do banco e cuidadosamente remover sobrenadante, evitando a pelota. Resuspenda grânulos em 50 µ l PBS-B.
    5. Após a incubação de 45 min com alvo na etapa 1.4.3, Centrifugar as células a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4° C, retire o sobrenadante e ressuspender as células no 50 µ l lavado grânulos de 1.4.4. Manter a amostra em gelo e etapas completas 1.3.7 - 1.3.13 para um tipo positivo.
    6. Inocule uma cultura de 5 mL de LB Cm25 suplementado com 0,2% m/v D-glicose com a fração positiva, grânulo contendo toda do tipo.
    7. No dia seguinte, use a cultura durante a noite para fazer estoques de congelador em LB contendo 15% de glicerol e/ou continuar à classificação positiva na próxima rodada, retornando para a etapa 1.4.1.
      Nota: Usando a cultura induzida de 1.4.2 para avaliar a afinidade de ligação e especificidade conforme descrito na seção 2 abaixo pode ajudar a determinar quando parar de classificação. Se mostram de duas rodadas de classificação em uma linha semelhante afinidade de ligação, ou fase mostra diminuição da afinidade de ligação para o destino de interesse, este um desejável lugar para impedir a classificação. Após a rodada final, o retorno à etapa 1.4.1 mas parar no 1.4.2.

2. FACS análise de classificação rodadas

  1. Usando as células induzidas da etapa 1.4.2 para cada rodada de classificação, ou culturas idênticas, adicione 5 µ l induzida por células de 25 µ l de cada uma das seguintes soluções preparadas para avaliação de associação (ver também quadro de materiais): PBS sozinho; PBS com 150 nM YPet Mona (YPet 12,13; controle positivo para a expressão), se disponível; alvo de proteína 900 nM conjugado com um corante fluorescente, como o corante reativo-amina com emissão/excitação em 493 nm⁄518 nm (alvo-488); 900 nM cross-reactive proteína alvo (s) usado para classificação negativa rotulado com a mesma tintura fluorescente (proteína Cross-Reactive-488); e 900 nM streptavidin-R-ficoeritrina (SAPE). Incube no gelo por 45 min.
    Nota: Se continuar diretamente da etapa 1.4.2, este passo irá sempre ser feito no dia seguinte o biopanning para aquela rodada foi concluída uma vez que a biblioteca selecionada para baixo foi cultivada durante a noite então repicagem e induzida no dia seguinte. Culturas cultivadas e similarmente induzido dos estoques rodadas classificação congelados também podem ser usadas; Nesse caso, todas as rodadas podem ser testadas e comparadas em uma única experiência.
  2. Células de centrífuga a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4° C. Remover o sobrenadante e armazenar as amostras no gelo.
    Nota: Aglomerados de células podem ser armazenados no gelo até que todas as amostras estão prontas para análise.
  3. Ligue o instrumento FACS, abra o software, a start-up do sistema e calibrar o instrumento instruções 43,44 do fabricantea seguir.
  4. Dentro do software de FACS, clique em "Administrador" e clique na pasta desejada ou criar uma "nova pasta". Clique sobre a "nova experiência" ícone no canto superior esquerdo da tela. Clique direito no ícone para "Renomear" experimento. Dentro dessa experiência, clique em "Planilhas Global".
  5. Clique no ícone "Dot Plot" e, em seguida, clique na planilha planilha global para criar este gráfico de dispersão. Clique no gráfico ponto enredo em si e, em seguida, selecione o "Inspector" ícone no topo esquerdo da tela e ajustar os eixos para biexponential display, selecionando as caixas ao lado do "eixo Y" e "Eixo X" na janela aberta. Feche a janela de exibição de biexponential clicando no X.
  6. Criar um "tubo de novo", clicando no ícone no topo esquerdo da tela e renomear o espécime com informações adequadas, botão direito do mouse no ícone do espécime sob "planilha global" e selecionando "Renomear". Expandir a amostra clicando no (+) sinal e, em seguida, clique duas vezes no ícone do tubo, clique direito sobre ele, e novamente selecione "Renomear" para descrever a amostra.
  7. Use este gráfico de plotagem ponto com padrão SSC-A vs FSC-A para executar uma amostra de controlo negativo em PBS sozinho Duplo clicando em tubo ou selecionando a seta ao lado dele. Apenas antes de executar o exemplo, Ressuspender as células em 500 µ l de gelo frio FACS correr buffer e amostra de transferência para um FACS do tubo (ver tabela de materiais), misturando bem por pipetagem e passar rapidamente o tubo. Coloque as células ressuspensa do tubo de injeção de amostra (SIT) do instrumento. Imprensa "adquirir" com "Eventos para exibir" em 30.000-50.000 e "Eventos para registro" em 10.000, fluxo de dados taxa em baixa (iniciar; aumentar, se necessário) e "flush" selecionado.
    Nota: A velocidade apropriada (baixa, média ou alta) é a velocidade na qual o número de eventos/s é aproximadamente entre 200 e 2000.  Use esta escala para todas as etapas.
  8. Ao adquirir, ajuste limiar de tensão photomultiplier tubo (PMT), se necessário, selecionando a guia "Limiar" clique na e mudar o "valor". Ajuste a tensão para dispersão de frente e lateral (SSC e FSC) tal que as células de controlo negativo em PBS sozinho cair ligeiramente abaixo do centro.
    Nota: Parâmetros adicionais (tais como SSC) podem ser adicionados na aba "Limiar" usando o ícone "Adicionar". Normalmente, tensões de PGTO de cerca de 700 V a 1000V para SSC e FSC funcionam bem para Escherichia coli.
  9. Se a amostra está lendo corretamente, ajuste a taxa de fluxo para exibir eventos de 200-2000/s e clique em "Gravar dados". Quando terminar de gravação, remover o tubo de sentar e colocar no gelo.  Escolha o ícone de "portão polígono" e use o mouse para desenhar um portão ao redor a maioria da população celular no gráfico de dispersão. Clique com o botão direito na trama do ponto e selecione "Mostrar hierarquia de população".
  10. Use este portão "P1" como um pai clicando no "P1" na hierarquia da população. Crie uma nova parcela de ponto passo 2.5 a seguir. Botão direito do mouse cada eixo e alterar o eixo de y para FITC-A e o eixo x para FSC-A. Portão do controlo negativo (PBS sozinho) usando o ícone de "portão de polígono", com o portão tão apertado quanto possível na parte superior e esquerda de população.
    Nota: Verifique a hierarquia de população para garantir que o portal P1 é um pai da porta P2. Se não for, ele aparecerá em consonância com o portão de P1 e "Todos os eventos" será o pai; excluir o portão e recriá-la seguindo o passo 2.10.
  11. Selecione "P2" na hierarquia de população, botão direito do mouse e selecione "inverter a porta". Clique com o botão direito sobre a trama de ponto com portão P2 e selecione "Mostrar as populações". Selecione as populações "P2" e "Não P2" para a exposição (menos de 1% da população deve cair fora do portão).
  12. A trama do ponto com P2 portão com o botão direito e selecione "Create View de estatísticas". Botão direito do mouse a janela de exibição de estatísticas e selecione "Editar exibição de estatísticas". Clique na guia "Populações" e adicionar ou remover populações, como desejado, incluindo o pai, P1 (P2 e não a P2 já devem ser mostrado). Clique na guia "Estatísticas" e adicione "FITC-A mediana" e outras estatísticas de interesse. Feche a janela pressionando Okey.
  13. Criar um gráfico de plotagem ponto semelhante para PE-A vs FSC-A e portão usando PBS em paz amostra (parcelas anteriores podem ser repetidas e alteradas). Use esta planilha para executar todas as amostras (incluindo células de controlo negativo incubadas com cada destino marcado fluoróforo) desta forma, cerca de 10.000 eventos de gravação para cada um.
    Nota: As células que caem fora do portão após incubação com a proteína do alvo-488, positivo, controle, etc. são ligantes para essa proteína, e o valor de "Não PX" (onde X é o número da população fechado para aquele gráfico) deve ser registado como % vinculado a YPet. Ao usar o SAPE como controlo negativo, use o enredo de FSC-A PE-A vs. A intensidade de fluorescência mediana (IFM) de P1 também deve ser registada como isto dá informações além da vinculação %, para mostrar a extensão da ligação em termos relativos e é mais robusto na presença de outliers 45. Intensidade de fluorescência mediana pode ser normalizada (NFMI), dividindo o IFM de cada peptídeo pelas IFM de um andaime somente de controlo negativo (com nenhum peptídeo N-terminal), ou um clone que contém uma sequência de peptídeo que não se vincula o destino de interesse, após incubação com o mesmo destino, conjugado com o fluoróforo mesmo 14. Se estas células de controlo negativo são indisponíveis, uninduced células incubadas com o mesmo destino e rotulado com o mesmo fluoróforo também podem ser usadas para normalização.

3. sequência análise dos potenciais candidatos e avaliação de vinculação afinidade

  1. Determinação de sequência do peptide
    1. Selecionar e sequenciar dezenas ou centenas de colônias bacterianas do round(s) final de biopanning (tipicamente rodadas 3 e/ou 4 são suficientes 14).
    2. Analisar a sequência de dados usando o arquivo de macro que desenvolvemos (Veja informações de apoio para o código, "Sub eCPX_Sequencing") para especificamente analisar as sequências geradas a partir biopanning 15mer bacteriana exibição biblioteca listada na tabela de materiais. Use o software de planilha eletrônica listado na tabela de materiais, ou outro software compatível preferencial.
      Nota: Um número de ferramentas está disponível online que também podem auxiliar no DNA sequência análise 47. Se preferir, usar um método diferente do estabelecido para análise de sequências e pule para o passo 3.1.3.
      1. Baixar o conjunto de arquivos de sequência (.seq arquivos, documentos de texto também funciona) e extraí-los em uma nova pasta. Se necessário, mover ou copiar a pasta para o disco rígido de computador (em oposição a uma pasta de rede) para maior velocidade.
      2. Abra uma nova janela de planilha. Certifique-se de habilitar macros e habilitar todos os recursos, se essas mensagens pop-up.
        Nota: As etapas 3 a 6 abaixo só devem precisar de ser concluída a primeira vez que a macro é usada. Para posterior análise, simplesmente "executar a Macro" começando na etapa 7.
      3. Copie todo o conteúdo da macro encontrado no arquivo "Sub eCPX_Sequencing".
        Nota: A versão atual está configurada com acompanhamento de sequências para a biblioteca de 15-mer listados na tabela de materiais e converterá os aminoácidos entre eles. Sequências adicionais podem ser digitadas, copiando 5' flanqueando sequências na coluna A e 3' flanqueando sequências na coluna B da planilha, até 10 sequências para cada um, antes de executar a macro.
      4. No arquivo de planilha em branco, selecione a guia "Exibir" e, em seguida, clique duas vezes em "Macros". Selecione a pasta de personal.xlb. Se este não estiver disponível, grave uma macro primeiro para tornar esta Definiç.
      5. Clique em "criar" ou "entrar", conforme o que pode ser destacado. Cole a macro de toda o módulo.
      6. Clique em salvar o ícone ou vá para arquivo, salvar. O módulo de saída. Se uma janela pop-up, pressione Okey.
      7. Executar a Macro: Vá até a pasta onde se encontram os arquivos desired.seq. Clique na barra ao lado do ícone da pasta na parte superior para visualizar a localização da pasta. Copiá-lo.
      8. Ir para a nova janela de planilha. Selecione a guia Exibir e, em seguida, clique duas vezes sobre macros. Selecione "eCPX_Sequencing" na lista e clique em "executar".
      9. Na caixa que aparece, colar o local do arquivo copiado na etapa 7 e tecle enter. A macro deve começar a atravessar as sequências e organizando-os em tabelas em várias folhas.
      10. Use a folha de "Tabela de resumo" para determinar se será necessário verificar arquivos de rastreamento de erros e fazer correções manualmente (se sequências contenham "X" ou não poderiam ser traduzidas).
        Nota: A tabela"Resumo" exibe as sequências de peptídeo traduzido, classificadas por sequência de aminoácidos (de À Z), a menos que um erro de sequenciamento impediu a tradução. Um "X" denota um aminoácido individual que não pôde ser determinado.
    3. Uma vez que as sequências são traduzidas, organizado, e quaisquer erros de sequenciamento corrigidos, verifique a lista de sequência de peptídeo classificada na folha de "Tabela de resumo" para as sequências de repetição.
    4. Cultivar culturas durante a noite para colônias sequenciadas de interesse (incluindo as repetições e/ou peptídeos com tendências perceptíveis no mínimo) em 5 mL LB Cm25 a 37 ° C, agitando a 225 RPM e salvar as existências do congelador no dia seguinte em LB contendo 15% de glicerol, como na etapa 1.4.7. testar os peptídeos com sequências de repetição para vinculação afinidade e especificidade usando os métodos de FACS descritos na secção 3.3 e usa o formato FASTA da lista de sequência (lista completa e repetições apenas) para alinhar as sequências usando alinhamento preferencial e programas de análise, como na seção 3.2.
  2. Alinhamento de sequências utilizando Clustal Omega, Kalign e programas similares
    1. Copie as sequências no formato FASTA da planilha FASTA da macro, ou caso contrário, criar uma lista de arquivos FASTA das sequências a serem alinhados (tais como aqueles da etapa 3.1.3).
      Nota: A coluna A contém os arquivos FASTA em ordem numérica por "Seq #" enquanto coluna B exibe-os classificados por "Sequência de AA" da folha de "Tabela de resumo". A lista de sequências peptídicas classificados pela sequência de aminoácidos irá exibir sequências inutilizáveis no topo, como vetor vazio (como "# vazio") e as sequências em que nem os critérios de pesquisa 5' ou 3' foram encontrados (como "# valor"). Este recurso permite a fácil atualização ou remoção dessas sequências a partir da análise.
    2. Abra Clustal Omega48 ou Kalign49 software, vá para o site 50,51, ou usar outro software preferencial para alinhamento de sequências. Copie e cole a lista de sequência FASTA e isso de entrada na caixa abaixo "sequências em qualquer formato suportado". Altere "pena de fosso aberto" para 30 em "mais opções" em Kalign (isso não é possível em Clustal Omega), mas caso contrário, mantenha as configurações padrão antes de clicar em "enviar".
    3. Analise o alinhamento de sequências utilizando software de53 de 52,Jalview diretamente dentro Clustal Omega e Kalign software on-line seleccionando o separador "Resumo do resultado" acima do alinhamento e clicando no ícone "Jalview".
      Nota: se preferir, ou para análise de alinhamentos de sequência gerado por programas alternativos, download 54 o software separadamente e copie e cole o alinhamento a janela de análise, que é aberta clicando em "Arquivo", "Alinhamento de entrada", e " da caixa de texto". Isto fornece um meio para determinar facilmente se uma sequência de consenso está presente no alinhamento da sequência de entrada.
  3. Comparando a afinidade de ligação e especificidade usando FACS
    1. Inocular 5ml LB Cm25 suplementado com 0,2% m/v D-glicose com cada indivíduo isolado de interesse (do passo 3.1.4 e/ou colônias de interesse de análise mais aprofundada de sequência na seção 3.2, etc) e um adequado controlo negativo (visor andaime somente ou um peptídeo que não se vincula alvo, conforme descrito na nota para etapa 2.13). Cresce durante a noite a 37 ° C, agitando a 225 RPM.
    2. Use as culturas durante a noite para inocular 3 mL LB Cm25 com 60 µ l de células (01:50 diluição). Incubar a 37° C com agitação a 225 RPM até que a cultura atinja uma OD600 de 0,5 - 0,55. Induzir a expressão de peptídeos com 0,04% w/v L-arabinose e mais 2 mM EDTA (para facilitação do peptídeo exibição 42), agitando a 225 RPM por 45 min a 37 ° C.
    3. Lugar induzida por culturas no gelo. Para cada isolado, adicionar 5 µ l células de 25 µ l PBS sozinho ou PBS contendo: 150 nM YPet 12,13 (controle positivo para a expressão), se disponível; 250 nM alvo-488; 250 nM Cross-Reactive somáticas-488; e 250 nM SAPE (ver 2.1 para mais detalhes). Incube no gelo por 45 min.
    4. Células de centrífuga a 6.000 x g, durante 5 min à RT ou 4° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante líquido de desenho do lado oposto da pelota. Loja pelotas de célula no gelo até todas as amostras e estou preparado para análise.
    5. Ressuspender cada célula em 500 µ l gelo frio FACS executando o tampão, misturando bem por pipetagem e passar rapidamente o tubo, antes de leitura utilizando um citômetro de fluxo (veja a tabela de materiais).
      Nota: Consulte Passo 2.13 notas para mais explicações de gating e cálculo de NFMI para comparar a especificidade e afinidade de ligação. Non-ligantes ou aglomerantes específico agora podem ser removidas de uma análise mais aprofundada, e os fichários de afinidade mais alta devem ser re-avaliados por alinhamento de sequências, seção 3.2 para procurar novas tendências que podem ter sido perdidas na inicial sequenciado a seguir população. Pontos 3.2 e 3.3 pode ser repetido conforme necessário como novas tendências e sequências de consenso são anotadas. Esta análise pode incluir sequências mais aleatórias se as tendências não são vistas.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o uso de célula magnética-ativado automatizado, classificação (autoMCS) ao invés de célula magnética manual de classificação, candidatos de negativos falsos são significativamente reduzidos durante biopanning de exibição bacteriana bibliotecas 9,14. Etapas de classificação negativas ser também podem ser adicionados conforme necessário para reduzir ligantes não-específica para o destino de interesse, e é sugerido no mínimo adicionar um tipo negativo contra o magnético se contas na frente. Esta selecção negativa contra os grânulos magnéticos se foi concluída antes de quatro rodadas de biopanning o escolhido bacteriano exibem biblioteca para ligantes de antígeno protetor (PA), conforme mostrado na Figura 2e antes de seleção negativa adicional contra rivax e quatro rodadas de seleção positiva para abrax, como mostrado na Figura 3. Os grânulos usados aqui são conjugados para streptavidin para captura de proteínas biotinilado, assim não intencional isolamento de peptídeos, vinculando a streptavidin em si é uma preocupação e é monitorado usando FACS com estreptavidina conjugada a ficoeritrina (Figura 3 , SAPE). No mínimo, vinculação de estreptavidina deve ser testada para qualquer promissores candidatos individuais, ao avaliar a ligação à proteína alvo. Tanto a vinculação de percentual e NFMI para SAPE devem ser valores baixos em todas as rodadas de classificação. O nível de ligação a streptavidin pode aumentar um pouco a cada rodada de classificação, como ocorreu na Figura 3, porque a população é exposta repetidamente para as esferas magnéticas streptavidin-revestido após cada rodada de classificação. Se o nível de fundo streptavidin ligação torna-se problemático para análise a jusante, mais classificação negativa contra os grânulos magnéticos poderia ser executada após a rodada de classificação positiva em que a população de vinculação de estreptavidina aumentou em fim de reduzir a jusante despistagem de falsos positivos. Quando proteínas ou materiais disponíveis que especificamente poderia interferir com o uso a jusante do peptide para uma aplicação específica, ou que se preveja a reação cruzada com os reagentes de afinidade para o alvo devido estrutural e/ou a similaridade da sequência, ainda mais negativa classificação contra que proteína ou material é recomendado. Um exemplo é a classificação negativa contra rivax antes de isolamento de peptídeos de ligação abrax, devido à semelhança estrutural e a homologia de sequência destas duas proteínas 1,15. Novamente, cross-reactive de ligação a proteínas usadas para negativo classificação etapas pode ser monitorado durante a análise de classificação rodadas usando FACS (Figura 3Rivax-488). Na melhor das hipóteses, NFMI e ligação por cento são baixos, como neste exemplo.

Quando disponível, um peptídeo de controlo positivo fixo, tais como o peptídeo P2X no C-terminal de andaime exposição produzido pela biblioteca bacteriana visor usada nos resultados da representante aqui, pode ajudar a determinar se a falta de vinculação afinidade no ensaio de FACS é devido à falta de expressão do visor do andaime em si, em vez de falta de afinidade do peptide(s) para o alvo. Na Figura 2 e Figura 3, YPet Mona vinculando a este P2X peptídeo é monitorado e demonstra que as primeiras rodadas de classificação expressam o andaime mal. Isto é provavelmente predominantemente devido a alta frequência de códons de parada em peptídeos de N-terminal na biblioteca aleatória, o que significa que o andaime em si não foi produzido. Outros efeitos podem contribuir Adicionalmente, tais como a presença de peptídeos com inesperados efeitos tóxicos para o Escherichia coli, ou diminuíram o crescimento ou peptídeo taxas de exibição por outras razões (por exemplo, mutações no genoma bacteriano). Adição de EDTA durante a indução pode melhorar expressão durante essas primeiras rodadas de classificação 42, mas ainda não foi testada. Obrigatório para YPet Mona em cada biopanning população é melhorada significativamente pelo 3o round. Comparando a Figura 2 Figura3, é também evidente que o nível de expressão pode ser melhorada, aumentando o tempo de indução-90 min (como na Figura 2YPet Mona) ao invés de 45 min (como na Figura 3YPet Mona), Embora 45 min é normalmente suficiente. Observe que o NFMI para YPet Mona é normalizado para o nível de vinculação YPet Mona das células de controlo negativo, para que valores próximos de 1.0 são típicos, se o nível de expressão é aceitável. Normalizar YPet Mona MFI para PBS sozinha IFM da mesma amostra também é uma forma válida para comparar os níveis de expressão relativa, mas dá valores bastante mais altos (comparar Figura 2 e Figura 3 com resultados de Sarkes et al. 2015 15).

Enriquecimento da biblioteca de peptídeos de vinculação para o alvo específico de interesse normalmente é conseguido dentro de três rodadas de classificação positivas, mas continuando a uma quarta rodada de classificação pode ser benéfico, como mostrado na Figura 2 e Figura 3 . Aqui, % vinculado as células e NFMI continuam a aumentar de 3 rodada a rodada 4 para ambos os alvos de exemplo, PA e abrax, que são in a box em vermelho na Figura 2 e Figura 3, respectivamente. As sequências de peptídeo maiores afinidade já podem estar presentes no round 3, mas são susceptíveis de enriquecer ainda mais na rodada 4, bem como, que auxilia na seleção para baixo de potenciais candidatos 14. Análise de sequências de 4 redondo tende a revelar sequências de repetição, e estas sequências de repetição são um excelente ponto de partida para afinidade e especificidade de determinação de sequência de análise e de consenso. A macro eCPX_Sequencing, fornecida como um suplemento para este manuscrito ajuda a agilizar esta análise inicial, conforme mostrado na Figura 4. Começo com uma pasta de .seq ou arquivos de texto, a sequência de DNA que se encontra entre os escolhidos 5' e 3' sequências é traduzido, organizado pela sequência de aminoácidos e analisado para número de resíduos de aminoácidos individuais em cada peptídeo. Lista classificada de sequências peptídicas isolado, como mostrado na tabela de resumo folha tela na Figura 4, pode ser usada para determinar facilmente quais sequências de repetição e com que frequência. As células nesta planilha contendo sequências de repetição são esboçadas em cores diferentes para análise mais fácil. É aconselhável verificar essas sequências de repetição para as sequências de consenso e outras tendências. Este é auxiliado pelo software de alinhamento de sequência como Kalign e Clustal Omega, e análise pode ser realizada sobre a saída de toda a sequência (incluindo sequências de repetição e não-repetição na frequência apareceram) e na lista de selecionados para baixo repetir sequências (com ou sem sua frequência relativa). Resultados representativos para PA e abrax repetindo sequências, sem tomar a frequência em conta, são mostrados na Figura 5A e 5B, respectivamente. Observe que na Figura 5A para o alvo de PA, várias das sequências de repetição individuais se conter a sequência consenso WFCFTC (ou uma sequência semelhante), sublinhada em vermelho, o que foi determinado aplicando-se análise do software Jalview para um Kalign alinhamento das sequências de repetição. Este consenso, como WXCFTC, foi anteriormente determinado a ser um consenso de vinculação de PA, que proporciona confiança na classificação método 9. Na Figura 5B, onde sequências de repetição para o destino de abrax foram analisadas da mesma forma, o resultado foi bem diferente. Primeiro, havia apenas cinco sequências que repetiu em 4 redondo de biopanning para abrax fichários, em oposição as quinze sequências de repetição isoladas do round 4 de biopanning para ligantes PA (embora 44% mais colônias também foram sequenciadas para PA). Em segundo lugar, nenhuma das cinco sequências de repetição continha a sequência mais promissor do "consenso" (FWAWF, sublinhada em roxo), embora o candidato AX-A15 contido a sequência que melhor correspondida (FWDTWF). Uma análise mais aprofundada, incluindo determinação de afinidade e especificidade vinculação, ajudada a fornecer o consenso de FWDTWF determinado a partir do top cinco candidatos para vinculação abrax na Figura 5, conforme explicado abaixo.

Uma colônia representativa de cada sequência de repetição pode ser analisada ainda mais para na célula afinidade e especificidade usando FACS, como na figura 6A para as sequências de repetição de biopanning para abrax peptídeos de vinculação. Aqui é claro que todos os cinco sequências de repetição tem maior afinidade para abrax, o alvo pretendido, que rivax, a proteína estruturalmente similar usada para classificação negativa, ou estreptavidina, que está presente durante a classificação devido as grânulos magnéticos usado para biopanning. Isto é consistente com os resultados promissores já por afinidade e especificidade das rodadas classificação mostrada na Figura 3, onde fica claro o enriquecimento para a ligação com o alvo pretendido, abrax, está aumentando a cada rodada de biopanning enquanto afinidade da proteína semelhante, rivax, não é. No entanto, uma sequência de consenso satisfatória não foi determinada para o tipo abrax usando a repetir sequências de redondo 4 sozinho (Figura 5B e acima de discussão). Regressavam às 100 colônias sequenciadas redondo 4, no entanto, observou-se a olho nu quando à procura de sequências similares para a melhor correspondência para o consenso previsto que um candidato adicional, AX-A12, continha a sequência FWDTWF que foi observada em isolar o AX-A15 , e que um outro candidato, AX-A14, continha um similar sequência, DWNTWF. Estas e outras sequências que continham semelhanças com as sequências de repetição, demonstraram semelhanças com outras sequências não-repetição ou foram escolhidas aleatoriamente, foram analisadas pela FACS para vinculação afinidade e especificidade. Os testados são classificados em Sarkes et al . 2016 1 e os top 5 ligantes a partir desta análise são mostrados na Figura 6B, com a sequência de consenso determinada a ser FWDTWF, mostrado na Figura 5.

Uma análise semelhante de vinculação afinidade para repetir sequências peptídicas no round 4 de biopanning para peptídeos que reconhecem o alvo de PA revelou que os fichários do melhores, como classificou-se pela relação de PA-488 nMFI:SAPE NFMI, continham o consenso WXCFTC ou um similar sequência (tabela 1). Usando esta relação, as sequências de auto organizaram em aqueles que continha o consenso e aqueles que não. Os melhores candidatos, todos contendo sequências relacionadas com o consenso, foram analisados da mesma forma para os métodos descritos acima para abrax na Figura 6, tal como apresentado em Sarkes et al . 2015 14. Estes resultados demonstram que, para alguns destinos, análise de peptídeos com sequências de repetição pode ser adequado para obter fichários com significativa afinidade e especificidade para um destino escolhido e para determinar uma sequência de consenso que pode ser, por si só, suficiente para vinculação. Entretanto, observe que o número de repetições não reflete necessariamente a afinidade de ligação relativa para o destino de interesse (tabela 1). Quando a análise de repetir sequências sozinhos não é suficiente para determinar um padrão, é útil para alternar entre análise de sequência e análise de vinculação para diminuir o número de candidatos e reexaminar as tendências entre os candidatos com maior afinidade . Mesmo quando observa-se uma tendência de analisar as sequências de repetição sozinhos, sequências adicionais de não-repetição podem demonstrar as mesmas tendências, ou outras tendências, mediante uma investigação futura.

figure-results-1
Figura 1: esquemático do protocolo biopanning para bibliotecas de exibição bacteriana. Conforme ilustrado aqui, biopanning bacteriana exibir bibliotecas é um processo cíclico. Cada célula bacteriana exibição biblioteca (ver tabela de materiais) contém o Plasmídeo, que é mantido, enquanto as células são cultivadas na presença do antibiótico para o qual o plasmídeo contém um gene de resistência (choloramphenicol neste caso). Cada plasmídeo também codifica a proteína de andaime de exposição que expõe um peptídeo aleatório para o exterior da célula. Desde que cada célula deve conter apenas uma sequência de DNA de plasmídeo único, cada célula deve exibir apenas um único peptídeo, em vários locais ao longo da membrana celular. Dependendo do nível de diversidade de biblioteca no início de biopanning e após cada rodada de classificação, a sequência de DNA pode ou pode não ser exclusiva de uma célula para outra. Biopanning começa com crescimento e indução da biblioteca de célula para exibir peptídeos individuais na sua membrana externa. Estes peptídeos então podem interagir com uma proteína do alvo (que é biotinilado ou caso contrário a tag para captura). Para célula magnética ativado classificação (MCS), desvinculado de proteína é removida e as células são incubadas com grânulos magnéticos que são revestidos com uma proteína de captura (streptavidin neste exemplo, que tem uma forte interação com biotina). Toda a cultura é então exposta a um ímã para separar células limite de pilhas unbound. Utilizando um dispositivo de classificação automatizado magnético é preferido para separação da pilha reduzir falsos positivos. Ilustrado aqui é um tipo positivo, em que as células que são vinculados a e co eluir com as esferas magnéticas são retidas. Para uma classificação negativa, o que normalmente realizamos na frente, o processo é o mesmo exceto que as células que são lavadas fora as esferas magnéticas são retidas em vez disso. A fração de biblioteca de interesse, vinculado (tipo positivo) ou desacoplado (tipo negativo), é crescido durante a noite e usado na próxima rodada de classificação. Cada rodada subsequente da positivo biopanning requer uma diminuição no volume de concentração e o grânulo de destino para melhorar o rigor. Após cada rodada de biopanning, afinidade e especificidade dos peptides para o destino de proteína são avaliados usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação para ajudar a determinar quando deve parar biopanning e começar a investigar candidatos individuais. Conforme necessário, sequenciamento de DNA e análise de sequência do peptide são executadas. Estas etapas de análise podem ser em si um processo cíclico, particularmente por revelar tendências individuais isolados após a rodada final de biopanning. Neste ponto, as tendências de sequência do peptide e/ou consenso está correlacionado com vinculação afinidade e especificidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: dados de exemplo para análise de FACS de classificação rodadas: alvo PA. Ligação de afinidade, conforme determinado pela FACS é mostrado após 4 rodadas de biopanning (tipo positivo) o escolhido bacteriano exibir a biblioteca de peptídeos de vinculação para o alvo, antígeno protetor (PA). Esta foi realizada após a primeira realização uma espécie negativa contra os grânulos magnéticos streptavidin-revestido. Para avaliação da vinculação, as células foram induzidas com 0,4% L-arabinose para 90 minutos antes da incubação com soluções alvo e controle e análise por FACS. Vinculação a análise de afinidade para o alvo pretendido é embalado em vermelho. Mostrados aqui são os gráficos de dispersão de FITC-A vs FSC-A e valores para células percentuais vinculados (em comparação com o controle negativo gated incubado com PBS sozinho) e normalizado a intensidade de fluorescência mediana (NFMI, em comparação com o controle negativo do peptide-free incubado com a mesma fluoróforo-etiquetou a proteína) de células induzidas que foram incubadas durante 45 min com: PBS buffer sozinho, 150 nM YPet Mona (controle positivo para a expressão do peptide), ou 250 nM PA-488 (rotulados como alvo). Observe o enriquecimento crescente na vinculação afinidade para o destino de interesse após cada rodada de biopanning. Em contraste com a Figura 3, todas as separações de célula autoMCS foram concluídas usando o programa Posselds. Parte destes dados também pode ser visualizada em gráficos de dispersão de FITC-H vs FSC-H em Sarkes et al . 2015 14 para comparação ao vs FITC-A FSC-A parcelas mostradas aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: dados de exemplo para análise de FACS de classificação rodadas: alvo abrax. Da mesma forma, a Figura 2, mostrada aqui é a afinidade de ligação comparativa para uma experiência completa biopanning, conforme determinado pela FACS. A biblioteca de exibição bacteriana foi submetida a classificação negativa contra os streptavidin-revestida de grânulos magnéticos, como ilustrado na Figura 2, mas então foi submetida a uma rodada adicional de classificação negativa contra uma proteína homóloga com estrutura semelhante e função, rivax, antes de executar 4 rodadas de positivo biopanning para peptídeos vinculativa para o alvo pretendido, abrax. Para avaliação da vinculação, as células foram induzidas com 0,4% L-arabinose por 45 min antes de vinculação de destino, controle positivo e negativos controles e lendo na FACS. Vinculação afinidade para o alvo pretendido é embalado em vermelho. Mostrados aqui são os gráficos de dispersão de FITC-A vs FSC-A (ou PE-A vs FSC-A no caso de sapé) e valores de células percentuais vinculado (em comparação com o controle negativo gated incubado com PBS sozinho) e NFMI de induzida por células que foram incubadas durante 45 min com : PBS buffer sozinho, 150 nM YPet Mona (controle positivo para a expressão do peptide), 250 nM Abrax-488 (alvo rotulado de proteína), 250 nM Rivax-488 (etiquetados potencial alvo de proteína cross-reactive), ou 250 nM SAPE (controlo negativo para ligação directa a streptavidin-revestido magnéticos grânulos). Observe o enriquecimento crescente em afinidade de ligação para o destino de interesse, abrax, após cada rodada de biopanning e afinidade de ligação mínima para a proteína estruturalmente semelhante, rivax. Em contraste com a Figura 2, positivo biopanning rodada 1 foi realizado utilizando os autoMCS programa Posselds enquanto subsequente classificação rodadas foram concluídas usando o programa Posseld, como sugerido por biopanning neste manuscrito. Esses dados também podem ser visualizados em gráficos de dispersão de FITC-H vs FSC-H em Sarkes et al . 2016 15 para comparação ao vs FITC-A FSC-A parcelas mostradas aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: análise de sequência de exemplo de saída usando a macro "eCPX_Sequencing". Mostrado é um screenshot de 48 colônias sequenciados de 4 redondo do biopanning biblioteca exibir bacteriana escolhido para ligantes PA usando o método Posselds. A folha de "Tabela de resumo" é mostrada aqui. Observe que as colônias estavam contadas em ordem alfabética de seus nomes de arquivo fornecido durante o processo de sequenciamento e que as caixas em torno de sequências que se repetem pelo menos uma vez são descritas em diferentes cores para análise de dados mais fácil. A macro eCPX_Sequencing é fornecida como um arquivo de código complementar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: sequência de determinação de alinhamento e consenso para dois alvos de proteínas distintas. Todas as imagens mostradas aqui foram geradas usando o software Jalview com coloração de Clustal_X depois de alinhar sequências de uso de software de análise online de Kalign 51. A) alinhamento de repetir sequências de PA biopanning rodada 4 (corresponde a tabela 1). B) alinhamento de repetir sequências de abrax biopanning rodada 4 (corresponde a figura 6A). C) o alinhamento dos candidatos do top 5 da abrax biopanning rodada 4, conforme determinado pela análise de FACS de candidatos individuais (corresponde a Figura 6B). A linha vermelha sublinha a sequência consenso em A e C, enquanto a linha roxa em B sublinha o precursor para a sequência de consenso determinado para abrax vinculação ao analisar sequências de repetição só, destacando o potencial necessário para testar a afinidade de ligação usando FACS antes um consenso pode ser determinado em alguns casos. Alinhamentos semelhantes gerados com software de análise diferentes podem ser vistos em Sarkes et al . 2015 14 e Sarkes et al . 2016 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: exemplo vinculação afinidade e especificidade para candidatos individuais analisados usando FACS. Mostrado aqui é a intensidade de fluorescência mediana normalizado (NFMI) determinada usando FACS para sequências A) repetição e B) os top 5 candidatos, conforme determinado pela afinidade de ligação comparativa para o alvo, abrax, do round 4 de biopanning. Os dados representam a média (bares) e desvio-padrão (barras de erro) de três experimentos independentes de replicar. Observe que todos os candidatos mostrados são bastante específicos para abrax (barras abrax-488, verdes) sobre uma proteína estruturalmente semelhante, rivax (barras Rivax-488, vermelhas) e o controlo negativo streptavidin (SAPE, barras pretas). Apesar das sequências de repetição em um (AX-07 e 15-AX) eram também entre os candidatos do top 5 em B, comparação de resultados em A e B demonstra que a análise de repetir sequências sozinho pode não ser suficiente para isolar os peptídeos de afinidade maiores. Dados mostrados aqui foram adaptados de Sarkes et al . 2016 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Tabela 1: relação de associação específica para ligação não específica para candidatos individuais repetição. Neste exemplo, o número de sequências de repetição e a relação de PA (alvo) NFMI para NFMI SAPE (controle negativo) são mostrados para as sequências de candidato repetição de PA biopanning rodada 4. Esses dados foi classificados por relativa proporção de NFMI PA nMFI:SAPE e analisados para a presença do consenso WXCFTC conhecido, ou uma sequência semelhante, que é mostrada na fonte em negrito e sublinhada. Observe que as sequências se auto-organizar tais que aqueles candidatos com o consenso tem a maior relação de NFMI PA nMFI:SAPE e, portanto, interagirem mais especificamente com o alvo. Os resultados mostrados são de uma única experiência de FACS. Peptídeos com menor afinidade para o alvo foram excluídos as repetições adicionais e análise que foram publicados em Sarkes et al . 2015 14.

Suppplemental arquivo 1: Clique aqui para baixar este arquivo.

Suppplemental arquivo 2: Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas tem sido uma abordagem bem-sucedida para o isolamento dos reagentes de afinidade, e peptídeos oferecem uma alternativa útil para anticorpos para reconhecimento quando critérios específicos são necessários, tais como a estabilidade em ambientes extremos. Foi racionalizado Biopanning dessas bibliotecas usando os autoMCS métodos descritos aqui, e uma plataforma de autoMCS disponíveis comercialmente esta tecnologia estende-se a uma audiência muito mais ampla. Em comparação com a tradicional alternância MCS/FACS métodos de triagem para bacteriano exibem bibliotecas, autoMCS métodos são menos caros, porque eles não exigem investimento em um instrumento mais caro de FACS capaz de classificar e isolar as células acopladas, em vez do tipo de citômetro de fluxo que é usado aqui, que só é capaz de análise 14. Os passos críticos para sucesso biopanning por autoMCS incluem a seleção de programa de separação, negativa de classificação contra Cruz-reagentes potenciais para reduzir falsos positivos, enriquecimento de biblioteca usando FACS para determinar quando parar biopanning, de monitoramento e análise inteligente da piscina para evitar incómoda triagem de centenas de candidatos candidato.

Os exemplos aqui descritos demonstram biopanning bem-sucedida da biblioteca exibir bacteriana escolhido para dois alvos distintos, PA e abrax, embora com estratégias de análise ligeiramente diferente devido a diferenças nas sequências peptídicas para cada pool de candidatos após quatro rodadas de biopanning. PA foi o caso mais simples, com análise de sequência demonstrando tendências claras das sequências peptídicas que repetido pelo menos uma vez em 144 colônias. Isto sozinho foi suficiente para determinar uma sequência de consenso para o alvo de PA e as colônias que continha o consenso ou uma sequência semelhante foram os melhores candidatos em termos de relação de vinculação para PA versus vinculação ao controle negativo estreptavidina. No entanto, isto não será sempre o caso. Para o destino de abrax, 100 colônias sequenciamento levaram a cinco sequências de repetição, mas a tendência nessas sequências foi menos clara, que não seja uma tendência conterem resíduos de aminoácidos aromáticos e ácido aspártico e asparagina. O "consenso" predito de sequências de repetição só poderia produzido e testado pela afinidade para abrax, mas como nenhum sequências de pai continham essa sequência consenso exato, voltamos à lista de colônias sequenciadas e observado que outros candidatos que tinha tendências mais em comum com os outros. Na verdade, duas colônias continham uma sequência semelhante ao "consenso" das sós, de repetições (FWDTWF em vez de FWAWF), que tinham a mesma tendência de resíduos de ácido aspártico, fenilalanina e triptofano, mas com espaçamento diferente. Dentre estes peptídeos foi uma sequência de repetição, um não foi. Estas duas sequências, juntamente com uma terceira sequência contendo uma variante semelhante, estavam entre os top 5 ligantes testados em termos de afinidade para abrax. O superior geral de fichário, AX-A05, também exibido tendências similares. Os resultados para abrax demonstram que uma abordagem que alterna várias vezes entre análise de sequência e análise de afinidade e especificidade às vezes será necessária, dependendo do destino escolhido. Os resultados para o destino de abrax também demonstram o nível de especificidade que pode ser alcançado por uma proteína muito semelhante (rivax 1,15).

Os programas de autoMCS selecionados para nossos estudos foram Posselds e Posseld, que são ambos para a selecção positiva das células alvo etiquetados com baixa frequência, a menos de 5% da população inicial. Em ambos os casos, as células passam por duas colunas magnéticas. No caso do programa de Posselds, no entanto, células passam mais lentamente a primeira coluna para aumentar o tempo de exposição 41. Além as descrições do programa fornecidas pelo fabricante do dispositivo autoMCS comercial (veja a Tabela dos materiais) 41, estes programas foram escolhidos após uma comparação inicial de vários programas de potenciais. Capacidade de cada programa para evitar puxar para fora de falsos positivos de uma cultura homogênea de células de controlo negativo e isolar com sucesso um fichário conhecido para um alvo de interesse de uma cultura mista, contendo células de controlo negativo cravadas com uma diminuição percentagem do fichário conhecidos, foram comparados. Se significativamente desviando as aplicações descritas aqui, uma comparação semelhante pode ser útil na seleção do programa para o novo aplicativo. No entanto, anteriormente publicados resultados comparando esses dois programas (Posseld e Posselds) para isolamento de peptídeo afinidade reagentes para PA mostrou que usar um desses programas para todas as quatro rodadas de biopanning levou ao isolamento de peptídeos com semelhante afinidade e especificidade para PA e determinação do consenso WXCFTC. As principais diferenças eram que Posseld, com sua taxa de fluxo mais rápida, resolvida mais rapidamente e vinculação afinidade para o alvo, portanto, foi maior depois de apenas duas rodadas de biopanning, enquanto usar Posselds levou a mais sequências únicas após quatro rodadas de biopanning 14. aprendendo com isso, a estratégia foi ligeiramente alterada quando biopanning para peptídeos de vinculação abrax incorporar ambos os benefícios: Posselds foi usado para o 1º Round para permitir mais tempo de exposição, durante esta etapa crítica onde diversidade é mais alta, mas depois o programa foi trocado para Posseld para mais rápido isolamento dos fichários de afinidade mais alta durante rondas 2-4 1,15. Isto parecia ser ideal para abrax, especialmente desde que o NFMI e a ligação por cento foram ambos superior para abrax classificação rodada 4 em comparação com PA 4 redondo com qualquer programa de triagem (Figura 2 e Figura 3 e Sarkes et al 2015 14), mas uma comparação direta usando a estratégia de um contra o outro com o mesmo destino seria necessária para uma comparação mais conclusiva. Qual programa é melhor para um determinado aplicativo pode depender o destino individual, biblioteca classificação usada e o nível de expressão de peptídeo que é alcançado com qualquer alteração às condições aqui descritas.

Não discutidos aqui são potenciais resultados de biopanning com materiais abióticos, mas também usamos a mesma biblioteca de exibição bacteriana por biopanning contra granel alumínio 2. Este estudo não foi realizado utilizando autoMCS, mas estudos semelhantes poderiam ser feitos usando o autoMCS, se o material está disponível, ou poderia ser revestido em ou conjugado, para uma esfera magnética. No estudo de alumínio grosso, aminoácidos individuais de análise e modelagem de estrutura secundária foi útil em compreender o que estava dirigindo a afinidade obrigatória dos peptides isolados, desde que nenhuma sequência de consenso foi determinado 2. Mesmo com alvos biológicos, podem ser necessário para entender o que está dirigindo a afinidade obrigatória para alguns destinos, é por isso que a planilha gerada a partir da macro "eCPX_Sequencing" inclui uma guia com análise de frequência de resíduos individuais. Se não há sequências de repetição são vistas além da falta de um consenso, e frequência de resíduo não mostra nenhum padrão, no entanto, outros tipos de análise podem ser necessários. Além disso, mais rodadas de classificação pode ser necessário para evitar um número muito maior de candidatos para seleção daqueles com afinidade suficiente para o destino desejado para baixo de triagem.

Com a crescente disponibilidade de sequenciamento de próxima geração, um estudo mais aprofundado poderia ser executado para determinar os candidatos mais promissores antes de testar a afinidade e para determinar o grau de enriquecimento após cada rodada de biopanning. Contudo, sequências de avançar para a etapa de análise de ligação podem precisar ser re-criado por clonagem, se eles não são de frequência alta o suficiente para isolar facilmente com sequenciamento de rotina da colônia de dezenas ou centenas de colônias. Como esta tecnologia avança, tornando-se menos caro e mais rotina, e especialmente com uma opção para isolamento de colônia, que provavelmente vai ser a melhor maneira de analisar os dados biopanning. Pode levar à elucidação das sequências de maneira individuais, e toda a biblioteca, evoluir. Além disso, as bactérias na biblioteca classificação podem sofrer mutações ao longo do tempo, que poderia influenciar a classificação para as células com mais rápido crescimento taxas ou bactérias que overexpress genômicas proteínas capazes de vincular um material mesmo sem expressão andaime e peptídeo de exibição, para instância. Por essa razão, uma vez que os candidatos promissores emergem, vale isolar o plasmídeo, retransforming fresco e. coli e confirmando a ligação peptídica através de FACS. Se planeja usar o peptídeo em um formato livre de célula, afinidade também deve ser avaliada para o peptídeo livre. Por exemplo, os reagentes de afinidade de peptídeo descobertos através de exposição bacteriana para o destino SEB foram produzidos sinteticamente fora-célula e analisados pelos métodos mais tradicionais como ensaio enzima-lig immunosorbant (ELISA) e na célula (através de FACS) e fora de células (através de ELISA) afinidade foram comparados usando o Kds determinado por ambos os métodos 7.

Embora a força da interação estreptavidina-biotina torna uma estratégia ideal para captura de proteína alvo e peptídeos ligados, este procedimento pode ser modificado para outras estratégias de captura. Acoplamento direto da proteína para grânulos magnéticos, como epóxi e grânulos de ácido carboxílico, tem sido bem sucedido e remove uma etapa de ligação. No entanto, ligação directa pode impedir potenciais sítios de ligação de forma específica ou não-específica, dependendo da estratégia de fixação. Uma vantagem adicional ao uso de grânulos de estreptavidina é que menos proteína estável alvos podem ser recém biotinilado em 30 min ou armazenados congelados, se necessário, enquanto os grânulos se tendem a exigir mais tempo incubação com a proteína para cross-linking e são geralmente armazenado a 2-8° C. A concentração inicial sugerida de biotinilado proteína alvo aqui, 600 nM, foi bem sucedido para vários destinos, mas pode ser possível isolar os reagentes de captura de peptídeo com afinidade aumentada se essa concentração é reduzida. Além disso, este método pode ser estendido para e modificado para outras bibliotecas de exibição bacteriana e outros organismos. Por exemplo, estas etapas podem ser executadas na ausência de oxigênio para uso com anaeróbios, ou em outros ambientes para uso com extremófilos para isolar peptídeos com propriedades únicas. Os peptídeos e/ou consenso determinado para um destino específico de interesse pode ser potencialmente usados na célula como a vida material, ou produzidos sinteticamente fora-célula. Peptídeos produzidos sinteticamente podem ser ainda mais amadurecidos para o desenvolvimento da afinidade ainda maior e mais robustos agentes de proteína catalisada capturar (PCC) para uso em sensores, ou para outras aplicações onde anticorpos costumam ser usados para vinculação ou reconhecimento 38,,55. Modelagem molecular pode também ser usada para ajudar a determinar a ligação local do peptide com seu alvo, como recentemente foi realizado para os peptídeos de ligação abrax e consenso listados na Figura 5 1. Em geral, bibliotecas de exibição bacteriana biopanning para reagentes de afinidade do peptídeo é uma alternativa rápida, simples e poderosa para a produção de anticorpos para o reconhecimento e detecção de alvos de proteína e esta biopanning semi-automático abordagem tem produzido resultados confiáveis com aplicações de grande envergadura.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de agradecer o apoio do laboratório de pesquisa de exército dos Estados Unidos (ARL) Postdoctoral Fellowship programa, administrado pela Oak Ridge Associated universidades através de um contrato com ARL, através da nomeação do Dr. Justin P. Jahnke. Restante de financiamento foi fornecido por sensores e direcção de dispositivos de elétrons no ARL. Os autores também gostaria de agradecer ao laboratório Daugherty na UCSB a biblioteca exibir bacteriana e informações para clonagem o reagente YPet Mona, Dr. Bryn Adams para apoio na clonagem o reagente YPet Mona no ARL, Dr. Joshua Kogot pelo seu trabalho inicial na e treinamento em biopanning de bacteriano exibir bibliotecas, Alena calma de Edgewood químicas e biológicas centro de partilha de plasmídeos usados para expressar e purificar abrax e proteínas rivax, Brandi Dorsey para obter suporte técnico para o isolamento de peptídeos de vinculação de PA, Qin Guo para suporte técnico de experimentos preliminares para isolamento de peptídeos de ligação abrax e Dr. Jessica Terrell em discussões úteis sobre este manuscrito.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545Separador de células automatizado para uso com esferas magnéticas
Luria Broth, Miller (LB)Fisher ScientificBP1426-500Meio de crescimento
CloranfenicolFisher BioReagentsBP904-100Ágar antibiótico
Fisher ScientificBP2641-500Agente
espessante/gelificanteeCPX 3.0 Biblioteca de Peptídeos de Exibição BacterianaCytomx TherapeuticsN/A; http://cytomx.com/contact/Biblioteca de exibição de peptídeos na célula. Fornecido por colaboradores da USCB.
L-arabinoseSigmaA3256-500GAçúcar, para indução de expressão de proteína
Tamponado com fosfato Salino pH 7,4 (PBS)Amresco0780-10LBuffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina, Sem PesoThermo ScientificPI21327Adiciona molécula de biotina a aminas primárias
Pierce Kit de Quantificação de BiotinaThermo ScientificPI28005Garante que a molécula de biotina esteja ligada covalentemente à proteína
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 BeadsInvitrogen65601Grânulos magnéticos para captura de proteínas conguadas com biotina
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA9647-100GProtein, usada como agente bloqueador para ligação não específica
D-glicoseSigmaG8270-1KGAçúcar, para crescimento e impedimento da expressão de proteínas induzíveis
Ypet MonaUCSB e ARLN/AControle positivo para monitoramento da expressão de eCPX 3.0. Produzido por autores e colaboradores; ver referências 12 e 13.
Dylight 488 NHS EsterThermo Scientific46403Para conjugar o alvo da proteína ao fluoróforo
Estreptavidina, conjugado R-Ficoeritrina (SAPE)Thermo ScientificS866Controle negativo para monitorar a ligação não específica à estreptavidina
BD FACSFlowBecton, Dickinson e Company342003Buffer para execução de colunas
autoMACS de instrumentos FACSMiltenyi Biotech130-021-101Para Separação MACS
autoMACS Running Buffer - Tampão de separaçãoMACS Miltenyi Biotech130-091-221Para manutenção de instrumentos autoMACS. Perigo: contém 0,09% de azida.
Solução de lavagem autoMACS ProMiltenyi Biotech130-092-987Para manutenção de instrumentos autoMACS
70% EtanolVWRE505-4LDescontaminação de autoMACS
GlycerolSigmaG6279-1LPara estoques de freezer bacteriano
Chill 15 rackMiltenyi Biotec130-092-952Para Separação MACS
BD FACSCanto IIBecton, Dickinson e Companhia744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overviewPara avaliação da ligação de peptídeos ao alvo
BD FACSDiva SoftwareBecton, Dickinson e Company659523Para avaliação da ligação de peptídeos ao
alvo Concentrador de partículas magnéticas Dynabeads MPC-SThermo ScientificA13346Separador de células de bancada para uso com esferas magnéticas
Sequenciamento deGenewizN/A; https://www.genewiz.com/Serviços de sequenciamento de DNA e colônias
ExcelMicrosoft323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400Para uso com análise de sequência macro
Antígeno protetor de antraz (PA)List Biological Laboratories, Inc.171Proteína alvo usada como exemplo para resultados representativos.
AbraxECBC e ARLN/AProteína alvo usada como exemplo para resultados representativos. Produzido por autores e colaboradores; ver referências 1 e 15.
RivaxECBC e ARLN/AProteína alvo usada como exemplo para resultados representativos. Produzido por autores e colaboradores; ver referências 1 e 15.
colônias

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504(2016).">Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504(2016).
  2. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).">Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).">Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).">Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75(2012).">Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75(2012).
  6. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).">Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).">Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).">Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925(2011).">Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925(2011).
  10. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).">Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).">Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).">Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).">Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1(2015).">Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1(2015).
  15. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).">Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).">Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).">Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).">Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).">Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).">Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).">Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).">Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).">Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).">Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).">Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).">Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).">Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).">Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).">London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).">Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985(2016).">Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985(2016).
  32. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).">Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).">Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).">Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).">Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).">Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).">Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).">Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).">Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).">Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).">Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474(2013).">Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474(2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).">BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).">BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).">Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. https://www.genewiz.com/ (2017).">Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).">Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539(2011).">Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539(2011).
  49. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298(2005).">Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298(2005).
  50. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).">EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).">EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).">Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).">Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. http://www.jalview.org/Download (2017).">Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).">Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial Display LibraryPeptide Affinity ReagentsBiopanning ProcedureSemi automated SortingFluorescence activated Cell SortingSequence Alignment AnalysisMagnetic activated Cell SortingOn cell Binding AssessmentConsensus Sequence IdentificationNegative Positive Sorting

Related Articles