Vi leverer enkle og robuste protokoller til behandling af biopsi materiale af forskellige arter, embryoner af biomedicinske modelorganismer og prøver af andre organiske væv for at muliggøre digital volumen data generation med den højopløselige episkopiske mikroskopi metode.
Vi leverer enkle protokoller til generering af digitale volumedata med HREM-metoden med højopløsnings-episkopisk mikroskopi. HREM kan forestille organiske materialer med volumener op til 5 x 5 x 7 mm 3 i typiske numeriske opløsninger mellem 1 x 1 x 1 og 5 x 5 x 5 μm 3 . Prøverne er indlejret i methacrylatharpiks og snittet på et mikrotom. Efter hvert afsnit indfanges et billede af blokoverfladen med et digitalt videokamera, der sidder på fotobåndet, der er forbundet med det sammensatte mikroskophoved. Den optiske akse passerer gennem et grønt fluorescerende protein (GFP) filterkube og er justeret med en position, hvor bockholderarmen hviler efter hver sektion. På denne måde produceres en serie af iboende justerede digitale billeder, der viser efterfølgende blokoverflader. Indlæser en sådan billedserie i tredimensionel (3D) visualiseringssoftware muliggør den øjeblikkelige konvertering til digitale volumedata, hvilket tillader virtuelle sEctioning i forskellige ortogonale og skrå planer og oprettelsen af volumen og overfladede computermodeller. Vi præsenterer tre enkle, vævsspecifikke protokoller til behandling af forskellige grupper af økologiske prøver, herunder mus, chick, vagtel, frø og zebrafiskembryoer, humant biopsiemateriale, ubestrøget papir og hududskiftningsmateriale.
Strukturel analyse af organiske og uorganiske materialer er det første skridt i at forstå deres fysiske egenskaber og funktion. Grundlaget for en sådan analyse er ofte todimensionale (2D) informationer opnået ved omhyggelig observation af histologiske sektioner med en række simple og sofistikerede billeddannelsesmetoder, der ekstraherer detaljer af vævarkitektur, cellemorfologi og topologi, molekylær sammensætning og biomekaniske egenskaber 1 , 2 , 3 . 2D-information er imidlertid ikke egnet til at undersøge rumligt komplekse arrangementer. Derfor er et stigende antal in vivo og ex vivo metoder, der tillader dannelsen af digitale volumedata, etableret i de sidste årtier 4 og mange flere er under udvikling.
Det metodiske princip for de fleste volumedatagenereringsmetoder er dannelsen af virtuelle stablerAf digitale billeder, der viser sektioner opnået ved virtuel eller fysisk sektion af et objekt. Hvis sektionsbillederne er korrekt justeret, skaber dette et volumen, der kan genopdeles i virtuelle sektionsplaner eller bruges til at oprette 3D overflade- og volumengengiverede modeller. Populære teknikker til visualisering af mennesker og større biologiske prøver er magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronemissionstomografi (PET) og single-photon emission computed tomography (SPECT). Små eksemplarer visualiseres som regel ved hjælp af mikromagnetisk resonansbilleddannelse (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiske sektionsbaserede metoder, konfokalmikroskopi og elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 <sUp>, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
En relativt ny volumen datagenereringsteknik, der producerer digitale data fra små prøver og histologiske vævsprøver, er HREM-metoden, som blev udviklet i tæt samarbejde med Tim Mohun 18 , 19 . Det er en simpel mikroskopbaseret teknik, der genererer digitale volumedata fra harpiksindlejret materiale, der er snittet på en mikrotome. Dataene lette detaljeret analyse af vævsarkitektur og celledistribution samt metrisk analyse af små funktioner på et mellemliggende lysmikroskopisk niveau.
HREM producerer stabler af iboende justerede digitale billeder, der vises som om optaget fra eOsinfarvede histologiske sektioner. Vævskontrast og dataopløsning i forhold til synsfeltet overstiger dataene produceret med μCT, μMRI og OPT, men er lavere end det, der kan opnås med konfokal, lysark og elektronmikroskopi 20 . I modsætning til sidstnævnte er HREM imidlertid i stand til at visualisere prøver med relativt store volumener på op til 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. En række nyere undersøgelser giver detaljerede karakteriseringer og sammenligninger af fordele og ulemper ved de enkelte billeddannelsesteknikker, og vi henviser af hensyn til objektivitet til dem for yderligere information om deres begrænsninger og potentielle anvendelsesområder 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .
Denne undersøgelse fokuserer på HREM billeddannelsesmetoden og sigter mod at giveMeget enkle protokoller til generering af HREM data fra et bredt spektrum af organiske materialer samt eksempler på deres anvendelse. Arbejdsstrømmen til oprettelse af HREM-data er enkel og gælder for alle materialer, der kan indlejres i methacrylatharpiks ( figur 1 ). Der er dog vævsspecifikke forskelle i prøvepræparation, der skal overvejes. Vi leverer derfor tre standardprotokoller til fremstilling af forskellige prøver. Indlejrings- og dataproduktionsprotokolstrin er ens for dem alle.
HREM er en meget robust mikroskopisk metode, der er ideel til visualisering af et bredt spektrum af organiske materialer anvendt i biomedicin og industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 38 , 39 , 40 . Det kan anvendes som en eksklusiv billeddannelsesmodalitet, som i øjeblikket anvendes af DMDD-programmets mekanismer 41 , 42 <suP>, 43 , 44 eller som en integrerende del af multimodale billeddannelsesrørledninger 45 .
Et fuldt fungerende HREM-datagenereringsapparat kan samles fra konventionelle laboratoriekomponenter og omfatter et motoriseret mikrotom, mikroskop, motoriseret tværsnit og en computer med passende software 25 . Det er kritisk at bruge et mikrotome udstyret med en blokholder, der reproducerbart stopper efter hver sektion i en bestemt position og GFP filterkuber inde i den optiske vej. Imidlertid kan fuldt fungerende all inclusive-løsninger købes hos virksomheder som Indigo Scientific.
HREM står over for de samme begrænsninger som alle histologiske teknikker, bortset fra at ingen artefakter introduceres under sektion eller sektionsmontering. Der er imidlertid begrænsninger, som skyldes nødvendigheden af at plette prøver før snitning ogFra embeddedmaterialets egenskaber. Penetration af eosin gennem hele prøven er påkrævet for at opnå tilstrækkelige vævskontraster; Meget tæt materiale, fedtvæv og anorganiske stoffer hindrer effektivt eosinindtrængning, og dette resulterer i ufarvet væv i midten af genstandene. Brug af specielle fixativer hjælper pletter hudprøver, men der er stadig ingen ordentlig metode til fuldt ud at overvinde problemet. En anden begrænsning er, at harpikser, der blokerer højere end 2 cm, har tendens til at bryde under snitning. Dette kan delvist undgås ved at skære prøverne og behandle dele separat.
Korrekt positionering af små prøver eller prøver med uregelmæssige overflader i forme under indlejring er ofte problematisk. Omsætning af prøverne med agarose og behandling af agaroseblokkene som beskrevet i protokollen løser normalt dette problem 19 . En alternativ tilgang, som også hjælper, hvis blokke brydes under sektionenAt fjerne den allerede hærdede blok fra holderen og indlejre den på ny efter den beskrevne indlejringsprocedure.
Et typisk HREM datasæt omfatter 500 til 3.000 enkeltbilleder. Dens numeriske opløsning bestemmes af afstanden mellem de successive billeder ( dvs. af sektionstykkelse), karakteristikken for kameraets mål og egenskaberne af den anvendte optik. Vi anvendte snittykkelser mellem 1 μm og 5 μm og opnåede gode resultater, selv om de præsenterede protokoller ikke fuldstændigt eliminerer skinner fra artefakter 20 , 46 . Disse artefakter er forårsaget af intenstfarvede væv placeret dybt inde i blokken, hvilket resulterer i uskarphed af vævsinformation på blokfladerne ved.
Kameraerne havde måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixels 2 , 2.048 x 2.048 pixels 2 og 4.096 x 4.096 pixels 2 og var combiNed med objektiver med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X og 20X. Dette resulterede i numeriske pixelstørrelser mellem 0,18 x 0,18 μm 2 og 5,92 x 5,92 μm 2 , hvilket viste sig at være tilstrækkeligt til 3D analyse af vævarkitektur og celleformer og endog til visualisering af kerner. I betragtning af den høje numeriske opløsning skal andre cellelegemer også være synlige. Utilstrækkelige kontraster på grund af simpel eosinfarvning, og de optiske egenskaber af målene reducerer dramatisk muligheden for at diskriminere strukturer. Den maksimale sande rumlige opløsning af HREM-dataene, der tager højde for den numeriske blænde, er ca. 1 x 1 x 1 μm 3 og tillader derfor kun effektiv diskrimination af strukturer større end ca. 3 x 3 x 3 μm 3 .
Et fælles problem for alle digitale billedteknikker er afvejningen mellem størrelsen af synsfeltet, som definerer den del af prøven, der kan visesD på kameraets mål og den numeriske opløsning af billedet. Jo større synsfelt, jo lavere er den maksimale mulige numeriske opløsning 46 . HREM-opsætningen, der anvendes her, tillader generering af HREM-data med et synsfelt mellem 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) vist i en numerisk opløsning på 0,18 x 0,18 μm 2 og 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25 x objektiv) vist i En numerisk opløsning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternative, kommercielle opsætninger kan give større synsfelter, men på bekostning af ægte opløsning. Ikke desto mindre giver de fremragende resultater, som det fremgår af de data, der vises på DMDD-programmets hjemmeside 47 .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Tim Mohun for sine invalubale bidrag til udvikling af HREM og Petra Heffeter for at give prøver.
JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
KL 2500 LCD | Schott AG | light source |