فحص الجزيئات النانوية النشطة بيولوجيا في الخلايا المناعية البلعمة لمثبطات مستقبلات تشبه تول
Summary
تشبه مستقبلات تول (تلر) يلعب دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية للكثير من الأمراض الالتهابية البشرية، وينظم تنظيم الاستجابة تلر من قبل النانوية النشطة بيولوجيا من المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية. توفر خلايا المراسل المستندة إلى الخلايا من نوع ثب-1 منصة فحص متعددة الاستخدامات وقوية لتحديد مثبطات رواية إشارات تلر.
Abstract
تنظيم الدوائية من مستقبلات تشبه تول (تلر) ردود يحمل وعدا كبيرا في علاج العديد من الأمراض الالتهابية. ومع ذلك، كانت هناك مركبات محدودة المتاحة حتى الآن لتخفيف الإشارات تلر ولم يكن هناك مثبطات تلر المعتمدة سريريا (باستثناء هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا) في الاستخدام السريري. في ضوء التقدم السريع في تكنولوجيا النانو، والتلاعب الاستجابة المناعية باستخدام أجهزة النانو قد توفر استراتيجية جديدة لعلاج هذه الأمراض. هنا، نقدم طريقة فحص الإنتاجية العالية لتحديد بسرعة الجسيمات النانوية الحيوية النشطة التي تمنع إشارات تلر في الخلايا المناعية البلعمة. وقد بنيت هذه المنصة الفرز على خلايا مراسل الخلايا القائمة على ثب-1 مع المقايسات اللونية وسوسيفيراس. تم تصميم خلايا مراسل من خط الخلايا أحادية الخلية ثب-1 الإنسان عن طريق التكامل مستقرة من اثنين من يبني مراسل محرض. واحد يعبر عن الجينات الجنينية الفوسفاتيز الجنينية (سيب)تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB و أب-1، والآخر يعبر عن الجينات مراسل وسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين تحرضها العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إرفس) .Upon تلر التحفيز، وتنشيط خلايا مراسل عوامل النسخ ثم تنتج سيب و / أو لوسيفيراس، والتي يمكن الكشف عنها باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة لها. باستخدام مكتبة من الجينات النانوية الببتيد الذهب (غنب) التي أنشئت في دراساتنا السابقة على سبيل المثال، حددنا واحد الببتيد-الناتج القومي الإجمالي الهجين التي يمكن أن تمنع بشكل فعال الذراعين لسلسلة إشارات TLR4 الناجمة عن يجند النموذجي، عديد السكاريد الشحمي (لس). تم التحقق من صحة النتائج من قبل التقنيات البيوكيميائية القياسية بما في ذلك إمونوبلوتينغ. وخلص تحليل آخر إلى أن هذا الهجين الرصاص له طيف مثبط واسع، يتصرف على مسارات متعددة تلر، بما في ذلك TLR2 و 3 و 4 و 5. ويسمح هذا النهج التجريبي بتقييم سريع(أو غيرها من المركبات العلاجية) يمكن أن تعدل إشارات محددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة.
Introduction
مستقبلات تشبه تول (تلرس) هي واحدة من العناصر الرئيسية في الجهاز المناعي الفطري المساهمة في خط الدفاع الأول ضد العدوى. تلرس هي المسؤولة عن الاستشعار عن غزو مسببات الأمراض من خلال الاعتراف ذخيرة من الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (أو بامبس) وتصاعد ردود الفعل الدفاعية من خلال سلسلة من التنبيه إشارة 1 ، 2 . هناك 10 تلرس الإنسان المحددة؛ باستثناء TLR10 التي تبقى فيها الليغاند غير واضحة، يمكن لكل تلر أن يعترف بمجموعة متميزة ومتحفظة من برامج تحليل الأداء. على سبيل المثال، TLR2 و TLR4، تقع أساسا على سطح الخلية، ويمكن الكشف عن البروتينات الدهنية والشحميات السكرية من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام، على التوالي. في حين أن TLR3 و TLR7 / 8 و TLR9، الموجودة أساسا في المقصورات إندوسومال، يمكن أن يشع رنا و دنا من الفيروسات والبكتيريا 3 . عندما تحفزها بامبس، تلرس تؤدي الاستجابات المناعية الأساسية عن طريق الإفراج المؤيدة لل إنفوسطاء تحريضية، وتجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المستجيب، وتنسيق الأحداث المناعية التكيفية اللاحقة 4 .
ويمكن تصنيف تنبئ التشوير تلر ببساطة إلى مسارين رئيسيين 5 و 6 . واحد يعتمد على محول البروتين عامل التمايز النخاعي 88 (MyD88) – مسار تعتمد على MyD88. تستخدم جميع تلرس باستثناء TLR3 هذا المسار لتفعيل عامل كابا-ليت-شينر العامل النووي من الخلايا B المنشطة (نف-κB) و كيناسيس البروتين المرتبط بالميتوجين (مابس)، مما يؤدي إلى التعبير عن وسطاء مؤيد للالتهابات مثل TNF- α، إيل-6 و إيل-8. المسار الثاني يستخدم تير-دومين-كونتينينغ-إنفوسد إنترفيرون-β (تريف) – المسار المستقل الذي يعتمد على تريف أو MyD88 – لتفعيل العوامل التنظيمية للإنترفيرون (إفرس) و نف-κB، مما يؤدي إلى إنتاج اكتب I إفنس. إشارات تلر سليمةأمر بالغ الأهمية لحمايتنا اليومية من الالتهابات الميكروبية والفيروسية. يمكن أن تؤدي العيوب في مسارات إشارات تلر إلى نقص المناعة وغالبا ما تكون ضارة بصحة الإنسان. 7
ومع ذلك، الإشارات تلر هو "سيف ذو حدين" والتنشيط المفرط وغير المنضبط تلر ضارة. تساهم ردود الفعل تلر أكثر نشاطا في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية الحادة والمزمنة الإنسان 8 ، 9 . على سبيل المثال، تعفن الدم الذي يتميز التهاب الجهازية والإصابة بأعضاء متعددة، ويرجع ذلك أساسا إلى الاستجابات المناعية الحادة الساحقة نحو الالتهابات، مع TLR2 و TLR4 لعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية الإنتان 10 ، 11 ، 12 . وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على TLR5 للمساهمة في التهاب الرئة المزمن من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 13، 14 . وعالوة على ذلك، يرتبط ارتباط إشارات تلر إندوسومال) مثل TLR7 و TLR9 (بقوة مع تطور وتطور العديد من أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتويدي) را ( 15 ، 16 . هذه الخطوط المتقاربة من الأدلة تحدد إشارات تلر كهدف علاجي محتمل للعديد من الأمراض الالتهابية 17 .
على الرغم من أن تنظيم الدوائية من الردود تلر ومن المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية، للأسف، هناك حاليا عدد قليل جدا من المركبات المتاحة سريريا لمنع إشارات تلر 9 ، 17 ، 18 . ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد وتكرار مسارات تلر المشاركة في التوازن المناعي وأمراض الأمراض. لذلك، والبحث عن رواية، بوتينيمكن أن تساعد العوامل العلاجية لاستهداف مسارات إشارات متعددة تلر على سد فجوة أساسية، والتغلب على التحدي المتمثل في دفع مثبطات تلر إلى العيادة.
في ضوء التقدم السريع في مجال علم النانو وتكنولوجيا النانو، نانودفيسس آخذة في الظهور كما الجيل القادم من المحولات تلر نظرا لخصائص فريدة من نوعها 19 ، 20 ، 23 . حجم النانو يسمح لهذه النانو العلاجات أن يكون التوزيع الحيوي أفضل واستمرار تداول 24 ، 25 ، 26 . ويمكن أن تكون فونكتيوناليزد أكثر لتلبية المطلوب الدوائية والدوائية ملامح 27 ، 28 ، 29 . أكثر إثارة، والنشاط الحيوي من هذه نانوديفيسس الرواية ينشأ من الخصائص الجوهرية، والتي يمكن أن تكون مصممة لبدلا من مجرد التصرف كوسيلة تسليم لعامل علاجي. على سبيل المثال، تم تصميم بروتين شحمي عالي الكثافة (هدل) لتثبيط إشارات TLR4 عن طريق مسح جزيئات TLR4 لس 23 . وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير نظام الهجين الجسيمات النانوية الببتيد الذهب، حيث الببتيدات مزينة يمكن أن تغير خصائص سطح الجسيمات النانوية الذهب، والسماح لهم أن يكون مختلف الأنشطة الحيوية 30 ، 31 ، 32 ، 33 . وهذا يجعلها فئة خاصة من المخدرات (أو "نانو المخدرات") كما الجيل القادم من العلاجات النانو.
في هذا البروتوكول، نقدم نهجا لتحديد فئة جديدة من الجسيمات النانوية الببتيد الذهب (الببتيد-غنب) التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات الإشارات متعددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة 32 ، </sup> 33 . ويستند هذا النهج على تجاريا المتاحة ثب-1 خطوط خلية مراسل. تتكون خلايا المراسل من اثنين من بنيات مراسل مستقر، محرض: واحد يحمل يفرز الجنينية الفوسفاتيز القلوية الجنينية (سيب) تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB والبروتين المنشط 1 (أب-1). والآخر يحتوي على جينات مراسل لوسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين محرض من العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إيرفس). عند التحفيز تلر، تنبئ إشارة يؤدي إلى تفعيل نف-κB / أب-1 و / أو إيرفس، الذي يتحول الجينات مراسل إلى سيب سرية و / أو لوسيفيراس. يمكن الكشف عن مثل هذه الأحداث بسهولة باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة مع الطيفي أو لومينوميتر. وباستخدام هذا النهج لفحص المكتبة التي تم إنشاؤها سابقا من الهجين الببتيد-غنب، حددنا المرشحين المحتملين التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات إشارات TLR4. النشاط المثبط للببتيد الرصاص -ثم تم التحقق من صحة الهجين الناتج القومي الإجمالي باستخدام نهج الكيمياء الحيوية آخر من إمونوبلوتينغ، وتقييمها على مسارات تلر أخرى. هذا النهج يسمح لفحص سريع وفعالة من العوامل الجديدة التي تستهدف مسارات إشارات تلر.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ تلرس تشارك في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية، فقد برزت كأهداف علاجية لتشكيل الاستجابات المناعية والظروف الالتهابية. ومع ذلك، فإن التطور السريري من العلاجات لمنع مسارات إشارات تلر كان نجاح محدود حتى الآن. هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا الذي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم المقدم من برنامج أستاذ التعيين الخاص (الباحث الشرقي) في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (هي)، وصندوق البداية من مستشفى الشعب الأول في شنغهاي (هي)، ودعم غاوفنغ الطب السريري منحة من شنغهاي جياوتونغ (هي)، والتمويل من مؤسسة كرون والتهاب القولون في كندا (سفك) (سيت و هي).
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
Referências
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O’Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O’Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
