Criblage de nanoparticules bioactives dans des cellules immunitaires phagocytaires pour les inhibiteurs de la signalisation des récepteurs de type péage
Summary
La signalisation des récepteurs à péage (TLR) joue un rôle important dans la pathophysiologie de nombreuses maladies inflammatoires humaines et la régulation des réponses TLR par nanoparticules bioactives devrait être bénéfique dans de nombreuses conditions inflammatoires. Les cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 fournissent une plate-forme de dépistage polyvalente et robuste pour identifier de nouveaux inhibiteurs de la signalisation TLR.
Abstract
La régulation pharmacologique des réponses des récepteurs Toll-like (TLR) est très prometteuse dans le traitement de nombreuses maladies inflammatoires. Cependant, des composés limités ont été disponibles jusqu'ici pour atténuer la signalisation TLR et il n'y a pas eu d'inhibiteurs cliniquement approuvés de TLR (à l'exception de l'hydroxychloroquine antipaludique) en usage clinique. À la lumière des progrès rapides de la nanotechnologie, la manipulation de la réactivité immunitaire à l'aide de nano-dispositifs peut constituer une nouvelle stratégie pour traiter ces maladies. Nous présentons ici une méthode de dépistage à haut débit pour identifier rapidement de nouvelles nanoparticules bioactives qui inhibent la signalisation TLR dans les cellules immunitaires phagocytaires. Cette plate-forme de criblage est construite sur des cellules rapporteurs à base de cellules THP-1 avec des tests colorimétriques et de luciférase. Les cellules rapporteurs sont conçues à partir de la lignée cellulaire monocytaire THP-1 humaine par intégration stable de deux constructeurs de rapporteurs inducibles. On exprime un gène de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP)Sous le contrôle d'un promoteur inducible par les facteurs de transcription NF-κ B et AP-1, et l'autre exprime un gène rapporteur de luciférase sécrété sous le contrôle de promoteurs inducibles par des facteurs régulateurs d'interféron (IRF). Lors de la stimulation TLR, les cellules rapporteurs activent Facteurs de transcription et ensuite produire SEAP et / ou luciférase, qui peuvent être détectés en utilisant leurs réactifs de substrat correspondants. En utilisant une bibliothèque d'hybrides peptides-or nanoparticules (GNP) établis dans nos études précédentes comme exemple, nous avons identifié un hybride peptide-GNP qui pourrait inhiber efficacement les deux bras de la cascade de signalisation TLR4 déclenchée par son ligand prototypique, le lipopolysaccharide (LPS). Les résultats ont été validés par des techniques biochimiques standard, y compris l'immunoblot. Une analyse plus approfondie a montré que cet hybride responsable avait un large spectre inhibiteur, agissant sur plusieurs voies TLR, y compris TLR2, 3, 4 et 5. Cette approche expérimentale permet une évaluation rapide deLa nanoparticule (ou d'autres composés thérapeutiques) peut moduler une signalisation TLR spécifique dans des cellules immunitaires phagocytaires.
Introduction
Les récepteurs Toll-like (TLR) sont l'un des éléments clés du système immunitaire inné contribuant à la première ligne de défense contre les infections. Les TLR sont responsables de la détection des agents pathogènes envahissants en reconnaissant un répertoire de motifs moléculaires associés aux pathogènes (ou PAMP) et en augmentant les réactions de défense par une cascade de transduction de signal 1 , 2 . Il y a 10 TLR humains identifiés; Sauf TLR10 pour lequel le ou les ligands restent incertains, chaque TLR peut reconnaître un groupe distinct et conservé de PAMP. Par exemple, TLR2 et TLR4, principalement situés sur la surface de la cellule, peuvent détecter les lipoprotéines et les glycolipides à partir de bactéries Gram-positives et Gram négatives, respectivement; Tandis que TLR3, TLR7 / 8 et TLR9, principalement présents dans les compartiments endosomaux, peuvent détecter les produits d'ARN et d'ADN à partir de virus et de bactéries 3 . Lorsqu'ils sont stimulés par les PAMP, les TLR déclenchent des réponses immunitaires essentielles en libérant pro-infLes médiateurs lammatoires, le recrutement et l'activation des cellules immunitaires effectrices, et la coordination des événements immunitaires adaptatifs subséquents 4 .
La transduction de signalisation TLR peut être simplement classée en deux voies principales 5 , 6 . L'un dépend du facteur de différenciation myéloïde de la protéine adaptateur 88 (MyD88) – la voie dépendante de MyD88. Tous les TLR, à l'exception de TLR3, utilisent cette voie pour activer le facteur nucléaire Kappa-chaîne légère activatrice de cellules activées B (NF-κB) et de protéines kinases associées à des mitogènes (MAPK), conduisant à l'expression de médiateurs pro-inflammatoires tels que le TNF- Α, IL-6 et IL-8. La deuxième voie utilise l'interféron-β inducteur d'adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF) – la voie indépendante de la dépendance de TRIF ou de MyD88 – pour activer les facteurs de régulation de l'interféron (IFN) et NF-κ B, ce qui entraîne la production de IFN de type I. Signalisation TLR intacteEst essentiel à notre protection quotidienne contre les infections microbiennes et virales; Les défauts dans les voies de signalisation TLR peuvent entraîner une immunodéficience et sont souvent préjudiciables à la santé humaine. 7
Cependant, la signalisation TLR est un «épée à double tranchant» et une activation excessive et non contrôlée de TLR est nocive. Les réponses TLR hyperactives contribuent à la pathogenèse dans de nombreuses maladies inflammatoires humaines aiguës et chroniques 8 , 9 . Par exemple, la septicémie caractérisée par une inflammation systémique et une lésion multi-organique est principalement due à des réponses immunitaires aiguës et écrasantes à l'égard des infections, avec TLR2 et TLR4 jouant un rôle crucial dans la pathophysiologie du septicémie 10 , 11 , 12 . En outre, TLR5 a contribué à l'inflammation pulmonaire chronique de patients atteints de fibrose kystique 13, 14 . En outre, la signalisation TLR endosomale dysregulée (par exemple, TLR7 et TLR9) est fortement associée au développement et à la progression de plusieurs maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux systémique (SLE) et la polyarthrite rhumatoïde (RA) 15 , 16 . Ces lignes convergentes de preuve identifient la signalisation TLR comme une cible thérapeutique potentielle pour de nombreuses maladies inflammatoires 17 .
Bien que la régulation pharmacologique des réponses TLR soit avantageuse dans de nombreuses conditions inflammatoires, malheureusement, il existe actuellement très peu de composés cliniquement disponibles pour inhiber la signalisation TLR 9 , 17 , 18 . Cela s'explique en partie par la complexité et la redondance des voies TLR impliquées dans l'homéostasie immunitaire et la pathologie pathologique. Par conséquent, la recherche de roman, potenLes agents thérapeutiques pour cibler de multiples voies de signalisation TLR pourraient combler une lacune fondamentale et surmonter le défi d'avancer les inhibiteurs de TLR dans la clinique.
À la lumière des progrès rapides de la nanocience et de la nanotechnologie, des nanodispositifs apparaissent comme les modulateurs TLR de nouvelle génération en raison de leurs propriétés uniques 19 , 20 , 23 . La taille nanométrique permet à ces nano-thérapeutiques d'avoir une meilleure distribution biologique et une circulation soutenue 24 , 25 , 26 . Ils peuvent être encore fonctionnalisés pour répondre aux profils pharmacodynamiques et pharmacocinétiques souhaités 27 , 28 , 29 . Plus activement, la bioactivité de ces nouveaux nanodispositions provient de leurs propriétés intrinsèques, qui peuvent être adaptées pourDes applications médicales spécifiques, plutôt que d'agir simplement comme un véhicule de livraison pour un agent thérapeutique. Par exemple, une nanoparticule à forte densité de lipoprotéines (HDL) a été conçue pour inhiber la signalisation TLR4 en éliminant le ligand TLR4 LPS 23 . De plus, nous avons développé un système hybride peptidique-nanoparticule d'or, où les peptides décorés peuvent altérer les propriétés de surface des nanoparticules d'or et leur permettre d'avoir diverses activités biologiques 30 , 31 , 32 , 33 . Cela en fait une classe spéciale de médicament (ou "nano-drogue") comme la nouvelle génération de nano-thérapeutique.
Dans ce protocole, nous présentons une approche pour identifier une nouvelle classe d'hybrides peptide-or nanoparticules (peptide-GNP) qui peuvent inhiber de manière efficace de multiples voies de signalisation TLR dans les cellules immunitaires phagocytaires 32 , </suP> 33 . L'approche est basée sur des lignées de téléphone journalières THP-1 disponibles dans le commerce. Les cellules rapporteurs sont constituées de deux constructeurs régulateurs stables et inducibles: l'un porte un gène de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) sous le contrôle d'un promoteur inducible par les facteurs de transcription NF-κB et la protéine activatrice 1 (AP-1); L'autre contient un gène rapporteur de luciférase sécrété sous le contrôle de promoteurs inducibles par des facteurs de régulation d'interféron (IRF). Lors de la stimulation par TLR, la transduction du signal conduit à l'activation de NF-κB / AP-1 et / ou IRF, ce qui active les gènes rapporteurs sur le SEAP secret et / ou la luciférase; De tels événements peuvent être facilement détectés en utilisant leurs réactifs de substrat correspondants avec un spectrophotomètre ou un luminomètre. À l'aide de cette approche pour l'affichage de notre bibliothèque préalablement établie d'hybrides peptidiques-GNP, nous avons identifié des candidats principaux qui peuvent inhiber de manière potentielle les voies de signalisation TLR4. L'activité inhibitrice du peptide plomb-Les hybrides GNP ont ensuite été validés en utilisant une autre approche biochimique de l'immunoblot et évalués sur d'autres voies TLR. Cette approche permet un dépistage rapide et efficace de nouveaux agents ciblant les voies de signalisation TLR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étant donné que les TLR sont impliqués dans la pathogenèse de nombreuses maladies inflammatoires, ils sont apparus comme des cibles thérapeutiques pour la modulation des réponses immunitaires et des affections inflammatoires. Cependant, le développement clinique de la thérapeutique pour inhiber les voies de signalisation TLR a connu un succès limité à ce jour. Le médicament antipaludique hydroxychloroquine qui inhibe TLR7 et TLR9 est en usage clinique 35 , <sup class="xref"…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le programme de professeur de nomination spéciale (Eastern Scholar) aux établissements d'enseignement supérieur de Shanghai (HY), le fonds de départ de Shanghai First People's Hospital (HY), le soutien de la médecine clinique Gaofeng de Shanghai Jiaotong La Faculté de médecine de l'Université (HY) et le financement de la Fondation canadienne de la maladie de Crohn et de la Colite (CCFC) (SET et HY).
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
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