Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝
Summary
Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
Toll-like receptor (TLR) 반응의 약리학 적 조절은 많은 염증성 질환의 치료에 큰 도움이됩니다. 그러나, TLR 신호 전달을 약화시키기 위해 지금까지 이용 가능한 제한된 화합물이 있으며, 임상 적으로 임상 적으로 승인 된 TLR 억제제 (항 말라리아 약물 하이드 록시 클로로퀸)는 없다. 나노 기술의 급속한 발전에 비추어, 나노 장치를 이용한 면역 반응의 조작은 이러한 질병을 치료하기위한 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 발명자들은 식세포 면역 세포에서 TLR 신호 전달을 억제하는 신규 한 생체 활성 나노 입자를 신속하게 동정하기위한 고 처리량 스크리닝 방법을 제시한다. 이 스크리닝 플랫폼은 표색계 및 루시퍼 라제 분석법을 갖춘 THP-1 세포 기반 리포터 세포를 기반으로합니다. 리포터 세포는 두 개의 유도 성 리포터 구조물의 안정한 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 조작된다. 하나는 분비 된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 유전자를 발현한다(NF-κB 및 AP-1에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에), 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도 가능한 프로모터의 조절하에 분비 된 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현한다. TLR 자극에 따라, 이어서 상응하는 기질 시약을 사용하여 검출 할 수있는 SEAP 및 / 또는 루시퍼 라제를 생산할 수있다. 이전의 연구에서 확립 된 펩타이드 – 금 나노 입자 (GNP) 하이브리드 라이브러리를 예로 들면 본 발명자들은 프로토 타입 리간드 인 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 유발 된 TLR4 신호 전달 캐스케이드의 두 팔을 효과적으로 억제 할 수있는 펩티드 – GNP 하이브리드를 확인했다. 연구 결과는 면역 블로 팅을 포함한 표준 생화학 기술로 검증되었습니다. 추가 분석 결과,이 납 하이브리드는 TLR2, 3, 4 및 5를 비롯한 여러 TLR 경로에 작용하는 광범위한 저해 스펙트럼을 가지고 있음이 입증되었습니다.이 실험적 접근 방식은ra nanoparticle (또는 다른 치료 화합물)은 식균 성 면역 세포에서 특이 적 TLR 신호 전달을 조절할 수있다.
Introduction
Toll-like receptors (TLRs)는 감염에 대한 첫 번째 방어선에 기여하는 타고난 면역 체계의 핵심 요소 중 하나입니다. TLRs는 병원체 관련 분자 패턴 (또는 PAMPs)의 레퍼토리를 인식하고 신호 전달의 계단식을 통해 방위 반응을 탑재하여 침입 병원체를 감지하는 책임이 있습니다 1 , 2 . 확인 된 10 개의 인간 TLR이 있습니다. 리간드가 불분명 한 TLR10을 제외하고, 각각의 TLR은 구별되고 보존 된 PAMP 군을 인식 할 수있다. 예를 들어, 주로 세포 표면에 위치한 TLR2와 TLR4는 그람 양성균과 그람 음성균의 지단백질과 당지질을 각각 검출 할 수 있습니다. 주로 엔도 솜 구획에 존재하는 TLR3, TLR7 / 8 및 TLR9는 바이러스 및 세균으로부터 RNA 및 DNA 생성물을 감지 할 수 있습니다 3 . PAMPs에 의해 자극되면 TLR은 pro-inf를 방출하여 필수 면역 반응을 유발합니다염증 매개체, 효과기 면역 세포의 모집 및 활성화, 후속 적응 면역 현상 조정 4 .
TLR 신호 전달은 두 가지 주요 경로 5 , 6 으로 간단히 분류 할 수 있습니다. 하나는 어댑터 단백질 골수 분화 인자 88 (MyD88) – MyD88- 의존 경로에 의존한다. TLR3을 제외한 모든 TLR은 활성화 된 B 세포 (NF-κB)와 mitogen-associated protein kinases (MAPKs)의 핵 인자 κ-light-chain-enhancer를 활성화시키기 위해이 경로를 이용하여 TNF-α와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 유도한다. α, IL-6, IL-8 등이있다. 두 번째 경로는 인터페론 (IFN) 조절 인자 (IRFs)와 NF-κB를 활성화시키기 위해 TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론 -β (TRIF), 즉 TRIF 의존적 경로 또는 MyD88 독립적 경로를 사용하여 I 형 IFN. 손상되지 않은 TLR 신호미생물 및 바이러스 감염으로부터 우리의 일상적인 보호에 중요합니다. TLR 신호 전달 경로의 결함은 면역 결핍을 초래할 수 있으며 종종 인간의 건강에 해로울 수 있습니다. 7
그러나 TLR 신호는 '양날의 검'이며 과도한 통제되지 않은 TLR 활성화는 해롭다. 과도한 TLR 반응은 많은 급성 및 만성 인간 염증성 질환에서 병인 발생에 기여합니다 8 , 9 . 예를 들어, 전신성 염증 및 다기관 손상으로 특징 지어지는 패혈증은 주로 패혈증 병태 생리학 10 , 11 , 12 에서 중요한 역할을하는 TLR2 및 TLR4와 함께 감염에 대한 급성, 압도적 인 면역 반응 때문입니다. 또한, TLR5는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 염증에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다 13, 14 . 또한, 조절 이상 엔도 좀 TLR 신호 전달 (예를 들어, TLR7 및 TLR9)을 강하게 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) 및 류마티스 관절염 (RA) (15, 16)를 포함한 여러자가 면역 질환의 발생 및 진행과 연관된다. 이러한 수렴되는 증거는 TLR 신호가 많은 염증성 질환 17에 대한 잠재적 인 치료 표적임을 확인합니다.
TLR 응답의 약리학 규제 많은 염증성 질환에 유용 할 것으로 예상되지만, 불행히도, 현재 TLR 9, 17, 18 시그널링 억제 임상 가능한 매우 적은 화합물이있다. 이것은 부분적으로 면역 항상성과 병리에 관련된 TLR 경로의 복잡성과 중복으로 인한 것입니다. 따라서, 소설, poten 검색다중 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 치료제는 근본적인 차이를 메워 줄 수 있으며 TLR 억제제를 진료소로 진출시키는 문제를 극복 할 수 있습니다.
나노 과학과 나노 기술의 급속한 발전에 비추어 볼 때, 나노 디바이스는 고유 한 특성 19 , 20 , 23 으로 인해 차세대 TLR 변조기로 부상하고 있습니다. 나노 크기는 이러한 나노 치료제가보다 나은 생체 분포와 지속적인 순환을 가능하게합니다 24 , 25 , 26 . 이들은 원하는 약물 동태 학 및 약물 동태 프로파일 27 , 28 , 29 를 충족시키기 위해 더 기능화 될 수있다. 보다 흥미롭게도,이 새로운 나노 디바이스의 생체 활성은 그 고유 한 특성에 기인한다.단순히 치료제의 전달 수단으로서의 역할을하기보다는 특정 의료 응용 분야에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 고밀도 지단백질 (HDL) 유사 나노 입자는 TLR4 리간드 LPS 23 을 제거함으로써 TLR4 신호 전달을 억제하도록 설계되었습니다. 또한, 우리는 펩타이드 – 금 나노 입자 하이브리드 시스템을 개발했다.이 시스템은 장식 된 펩타이드가 금 나노 입자의 표면 특성을 변화시켜 다양한 생체 활성 30 , 31 , 32 , 33 을 가질 수있게한다. 이것은 차세대 나노 치료제로서 그들에게 특별한 종류의 약물 (또는 "나노 약물")을 만듭니다.
이 프로토콜에서는 탐식 면역 세포에서 여러 TLR 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 새로운 종류의 펩타이드 – 금 나노 입자 (peptide-GNP) 하이브리드를 확인하는 접근법을 제시합니다 32 , </sup> 33 . 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 THP-1 리포터 세포주를 기반으로합니다. 기자 세포는 2 개의 안정한 유도 성 기자 구조로 이루어져있다. 하나는 전사 인자 NF-κB 및 활성화 제 단백질 1 (AP-1)에 의해 유도되는 프로모터의 제어하에 분비 된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 유전자를 보유한다. 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에 분비 된 루시 페라 제 리포터 유전자를 함유한다. TLR 자극시, 신호 전달은 NF-κB / AP-1 및 / 또는 IRFs의 활성화를 유도하며, SEF 및 / 또는 루시퍼 라제를 비밀하기 위해 리포터 유전자를 활성화시킨다. 이러한 이벤트는 분광 광도계 또는 루미넌스로 대응하는 기질 시약을 사용하여 쉽게 검출 할 수 있습니다. 이전에 확립 된 peptide-GNP 잡종 라이브러리를 스크리닝하기 위해이 방법을 사용하여 우리는 TLR4 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 납 후보 물질을 동정했다. 리드 펩티드 -그런 다음 GNP 잡종을 면역 블로 팅의 또 다른 생화학 적 접근법을 사용하여 검증하고 다른 TLR 경로를 평가했다. 이러한 접근법은 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 신규 약제의 신속하고 효과적인 스크리닝을 가능하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TLR은 많은 염증성 질환의 발병 기전에 관여하기 때문에 면역 반응 및 염증 상태의 조절을위한 치료 표적으로 부상하고있다. 그러나, TLR 신호 전달 경로를 억제하는 치료제의 임상 개발은 지금까지 제한된 성공을 거두었 다. TLR7과 TLR9를 억제하는 항 말라리아제 인 하이드 록시 클로로퀸 (hydroxychloroquine)은 임상 적으로 사용됩니다 35 , 36 . 마찬가지로, 화?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Shanghai First People 's Hospital (HY)의 초기 기금 인 Shanghai Institute of Higher Learning (HY)의 특별 임용 (Eastern Scholar) 교수 프로그램, Shanghai Jiaotong의 Gaofeng Clinical Medicine Grant 지원에 대한 지원을 인정하고자합니다. (HY), 캐나다의 Crohn 's and Colitis Foundation (CCFC) (SET 및 HY)의 기금으로 구성되어 있습니다.
Materials
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
Referências
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