经优化的 LC/ms 方法对囊性纤维化患者 Ivacaftor 及其主要代谢物和 Lumacaftor 的高通量分析
Summary
Ivacaftor 和 Ivacaftor-lumacaftor 结合是两个新的 CF 药物。然而, 在他们的 PK/PD 和药理学方面仍然缺乏了解。本文提出了一种优化的 HPLC-MS 技术, 同时分析 ivacaftor 及其主要代谢产物, 以及 lumacaftor。
Abstract
囊性纤维化膜传导调节剂 (CFTR) 的缺陷是囊肿纤维化 (CF) 的病因, 是一种具有生命危险的肺部表现的疾病。Ivacaftor (Ivacaftor) 和 lumacaftor (LUMA) 结合是两种新的突破性药物, 直接调节有缺陷的 CFTR 蛋白的活性和贩运。然而, 对药代动力学/药效学参数和 ivacaftor 和 lumacaftor 的药理研究仍然缺乏认识。高效液相色谱-MS 技术同时分析接受标准 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 结合的 ivacaftor、羟甲基 ivacaftor、ivacaftor 羧酸和 lumacaftor 在生物体液中的浓度治疗之前, 我们的小组和部分验证的 FDA 标准。然而, 为了允许高通量分析更多的患者样本, 我们组通过使用较小孔径的反相色谱柱 (2.6 µm、C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) 和梯度溶剂系统对报告的方法进行了优化 (0-1 分钟: 40% B;1-2 分钟: 40-70% B;2-2. 7 分钟: 举行在 70% B;2.7-2.8 分: 70-90% B;2.8-4.0 分钟: 90% B 洗涤;4.0-4.1 分: 90-40% B;4.1-6.0 分钟: 举行在 40% B) 而不是一个等洗脱。本研究的目的是将每样样品的高效液相色谱-MS 分析时间从 ~ 15 分钟减少到每样6分钟, 这对于分析大量患者样本是必不可少的。这种权宜之计的方法将有相当大的效用, 研究的接触反应的关系, 这些突破 CF 药物。
Introduction
囊性纤维化 (CF) 是一种常见的遗传性疾病, 涉及的外分泌粘液腺体的肺, 肝, 胰, 和肠道导致渐进性多衰竭, 如肺功能减退和胰不足1, 2,3。Ivacaftor (美国食品和药物管理局) 和欧洲药物管理局 (EMA) 批准囊性纤维化反式膜电导调节剂 (CFTR) 增药物, 其临床疗效显著G551D-CFTR 的小子集的 cf 患者肺功能改善的临床研究 [甘氨酸 (G) 在位置551中被天门冬氨酸 (D)] 义突变 (CF 种群的 4-5%)4,5。这种口服药物增加了 CFTR 通道开放, 从而增加了氯离子流和作用于主要缺陷, 导致的临床表现 CF4,6。不幸的是, 在更常见的纯合 F508del 突变的患者中, CFTR 单药的单一性是不有效的 [在帧删除的错误, 导致在位置508的苯丙氨酸 (F) 的损失, 这在50%CF 填充7,8。
最近, FDA 批准了与 CFTR 校正药物 lumacaftor 的结合。巧妙的策略, 结合 CFTR 校正器 (lumacaftor, LUMA), 这将 F508del-CFTR 到细胞表面的调制器 (伊娃) 加强 CFTR 通道活动, 有效地扩大治疗窗口的大多数 CF 人口5.关于这些药物是否能履行他们的诺言的问题仍然存在, 因为一些相互矛盾的报告已经出现, 对他们的临床功效产生了怀疑9,10。此外, 肺功能的改善只是适度的 (2.6-4% 的 ivacaftor-lumacaftor 组合) 相比, 成功地在 G551D 突变 (10.6-12.5%)8患者单药单一治疗。潜在的拮抗药物-药物相互作用可能限制 ivacaftor-lumacaftor 结合的临床疗效的 LUMA, 来自其不太理想的药代动力学属性7,11。在细胞色素 P450 酶 (CYP) 的作用下, 主要对活性代谢产物羟甲基–IVA-M1、M1) 和非活动形态 (IVA-M6, M6)7,12进行了广泛的代谢。CYP3A4 诱导 LUMA, 另一方面, 没有广泛的代谢和主要排泄不变的粪便11。由于 CYP3A4 诱导诱导细胞色素代谢, ivacaftor (CYP3A4 基质) 浓度可降低。此外, 两个 LUMA 都是非常疏水性分子和99% 绑定到血浆蛋白, 这极大地限制了自由 (有效) 药物浓度1,13。
总的来说, 这些因素可能聚集在一起, 限制了 ivacaftor-lumacaftor 结合的临床疗效。目前尚不清楚 ivacaftor-lumacaftor 组合的剂量方案是否达到最佳血浆浓度, 或者治疗阈值是否保持在8。目前, 关于 ivacaftor 或 ivacaftor lumacaftor 的药代动力学参数如峰值和稳态等离子体浓度的信息缺乏。鉴于 ivacaftor 和 lumacaftor 的新陈代谢, 对接触反应关系的监测是实现 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 疗法最佳剂量方案的必要条件。我们的小组最近出版了第一个 HPLC/LC-MS 方法, 以监测的接触-反应关系的 LUMA 和14。目前还没有其他方法来测量 ivacaftor、其代谢物和 lumacaftor 的浓度。为了让更大的患者集体的高通量分析, 并大大减少分析时间, 我们组通过使用较小孔径的反相色谱柱和梯度溶剂系统优化了报告的方法,降低成本和运行时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
如前所述, 我们的小组首次开发和验证了高效液相色谱和 LC-MS 法快速检测和定量 ivacaftor 及其主要代谢物羟甲基 M1 (活性) 和 M6 (不活泼);lumacaftor 在 CF 患者血浆和痰液中的浓度为14。本组报告的检测方法成功地用于定量测定 CF 患者的血浆和痰中 LUMA、IVA-M1、IVA-M6 的浓度, 采用150毫克/q12 h (拉丁语术语: quaque12 小时;每12小时一次) 或200毫克/q12 h LUMA-125 毫克/q12 h 综合体组合<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. 和电视得到国立卫生研究院 ( R01 AI111965 ) 国家反应和传染性疾病研究所 ( NIAID ) 的支持。内容完全是作者的责任, 并不一定代表国家过敏和传染性疾病研究所或国立卫生研究院的官方观点。MC 是澳大利亚澳洲的主要研究员。. 是澳大利亚国家卫生与医学研究委员会 (澳洲) 高级研究员, 而电视是澳大利亚澳洲行业职业发展2级研究员。杨永强 S 是一个任命的年轻大使2017为 ASM (美国微生物学协会) 并且由澳洲研究生奖支持。
这项工作的一部分是在 12th Australiasian 会议上囊性纤维化在墨尔本 (5-8th 2017年8月)。
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
Referências
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