Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten
Summary
Combinatie van Ivacaftor en ivacaftor-lumacaftor zijn twee nieuwe CF-drugs. Er is echter nog steeds een gebrek aan overeenstemming inzake hun PK/PD en farmacologie. We presenteren een geoptimaliseerde HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan, en lumacaftor.
Abstract
Gebreken in de cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) zijn de oorzaak van cystic fibrosis (CF), een ziekte met levensbedreigende pulmonale manifestaties. Ivacaftor (IVA) en ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combinatie zijn twee nieuwe doorbraak CF drugs die rechtstreeks het moduleren van de activiteit en de handel van het defecte CFTR-eiwit. Er is echter nog steeds een gebrek aan inzicht in de farmacodynamische/farmacokinetische parameters en de farmacologie van ivacaftor en lumacaftor. De HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van de concentraties van ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylaat en lumacaftor in biologische vloeistoffen in patiënten die standaard ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor combinatie therapie eerder is ontwikkeld door onze fractie en gedeeltelijk gevalideerd aan de FDA-normen. Echter, zodat de analyse van de hoge-doorvoer van een groter aantal monsters van de patiënt, heeft onze fractie geoptimaliseerd de gerapporteerde methode door het gebruik van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) en een kleurovergang oplosmiddel systeem ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: gehouden op 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B spoelen; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: gehouden op 40% B) in plaats van een isocratic elutie. Het doel van deze studie was om sneller op de HPLC-MS analyses per monster dramatisch van ~ 15 min te slechts 6 minuten per monster, die essentieel is voor de analyse van een grote hoeveelheid patiënt monsters. Deze raadzaam methode zullen van groot nut voor studies in het blootstelling-respons relaties van deze doorbraak CF drugs.
Introduction
Cystic fibrosis (CF) is een gemeenschappelijke genetische ziekte waarbij de exocrine slijm klieren van de longen, lever, alvleesklier en darmen veroorzaken progressieve multi orgaanfalen, zoals een afname in longfunctie en alvleesklier insufficiëntie1, 2,3. Ivacaftor (IVA) is de eerste Food and Drug Administration (FDA-US) en het Europees geneesmiddelen Agentschap (EMA) goedgekeurd cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) potentiator drug, met blijkt klinische werkzaamheid produceren een aanzienlijke verbetering van de longfunctie over placebo in een kleine ondergroep van CF patiënten rekening houdend met de G551D-CFTR [glycine (G) in positie 551 wordt vervangen door asparaginezuur (D)] missense Mutatie (~ 4-5% van de bevolking van CF)4,5. Dit oraal toegediend drug verhoogt het CFTR-kanaal openen, dus het chloride-ion stroom te verhogen en reageren op de primaire afwijking die tot de klinische uitingen van CF4,6 leidt. Helaas, IVA monotherapie is niet effectief bij patiënten met de gemeenschappelijkere homozygoot F508del mutatie [in frame schrapping van het CFTR-gen dat in het verlies van fenylalanine (F) op positie 508 resulteert] wat resulteert in misfolded CFTR, die wordt gezien bij ~ 50% van de CF bevolking7,8.
Onlangs, de FDA goedkeuring heeft verleend voor het combineren van IVA met het CFTR-corrector drug lumacaftor. De slimme strategie van het combineren van een CFTR-corrector (lumacaftor, LUMA) die redt F508del-CFTR aan het celoppervlak met een modulator (IVA) die potentiates CFTR kanaal activiteit, wordt het venster van de behandeling effectief vergroot tot allermeest naar de CF bevolking5 . Vragen blijven over of deze drugs zal voldoen aan hun belofte als een aantal tegenstrijdige verslagen die cast twijfel op hun klinische werkzaamheid9,10 opgedoken. Bovendien verbeteringen in de longfunctie slechts bescheiden (2.6-4% voor de combinatie van de ivacaftor-lumacaftor) waren in vergelijking met de successen die zijn behaald met IVA monotherapie bij patiënten met een G551D Mutatie (10.6-12,5%)8. Potentiële antagonistische drug-drug-interacties tussen IVA en LUMA die potentieel de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie beperken, is afkomstig van de farmacokinetische eigenschappen ervan minder dan ideale7,11. IVA uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd door cytochroom P450 enzymen (CYP), voornamelijk voor een actieve metaboliet hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) en een inactieve vorm IVA-carboxylaat (IVA-M6, M6)7,12. De CYP3A4 inductor LUMA, aan de andere kant, niet uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd en wordt grotendeels onveranderd in de ontlasting11uitgescheiden. Zoals CYP3A4 inductoren cytochroom metabolisme induceren, kunnen ivacaftor (CYP3A4 substraat) concentraties worden verminderd. Bovendien zowel IVA en LUMA zijn zeer hydrofobe moleculen en zijn ~ 99% gebonden aan plasma-eiwitten, die aanzienlijk beperkt de vrije (actieve) drug concentratie1,13.
Collectief, kunnen deze factoren komen samen om te beperken van de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie. Het is niet bekend of optimale plasmaconcentraties worden bereikt onder de huidige doseringsschema voor ivacaftor-lumacaftor combinatie of als de therapeutische drempel8wordt gehandhaafd. Momenteel, is er een schaarste aan informatie met betrekking tot de farmacokinetische parameters, zoals de piek en steady-state plasmaconcentraties van ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor. Gezien het bekende metabolisme van ivacaftor en lumacaftor, is toezicht op blootstelling-respons relaties het vereiste om de optimale dosering regimes voor ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor-therapie. Onze fractie heeft onlangs de eerste HPLC/LC-MS methode voor het toezicht op blootstelling-respons relaties van IVA en LUMA14. Tot nu toe geen alternatieve technieken voor het meten van de concentraties van ivacaftor, zijn metabolieten en lumacaftor gemeld. De analyse van de hoge-doorvoer van een grotere patiënt collectief toestaan en analyse tijd drastisch te verminderen, onze fractie de gerapporteerde methode door middel van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte en een kleurovergang oplosmiddel systeem is geoptimaliseerd dat vermindert kosten en lopende tijden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals eerder gemeld heeft onze fractie voor het eerst ontwikkeld en gevalideerd een HPLC en LC-MS methode voor snelle detectie en kwantificering van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan hydroxymethyl-IVA M1 (actief) en IVA-carboxylaat M6 (inactief); en lumacaftor in het plasma en sputum van CF patiënten14. De bepaling eerder gerapporteerd door onze fractie werd met succes gebruikt voor het kwantificeren van de concentratie van LUMA, IVA, IVA-M1 en IVA-M6 in het plasma en sputum van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L. en T.V. worden ondersteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (R01 AI111965). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten of de National Institutes of Health. MC is een Australische NHMRC Principal Research Fellow. J. L. is een Australische nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) Senior Research Fellow en T.V. is een Australische NHMRC industrie carrière ontwikkeling niveau 2 Research Fellow. E.K.S is een benoemde Ambassadeur van de jonge 2017 voor ASM (American Society for Microbiology) en wordt ondersteund door de Australische Postgraduaat Award.
Delen van dit werk werd gepresenteerd op de 12th Australiasian conferentie over Cystic Fibrosis In Melbourne (5-8th van augustus 2017).
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
- Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
- Solomon, M., Leatte, P. N. . Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
- O’Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- FDA. . FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , (2015).
- Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?. Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
- Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- EMA, . Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
- VERTEX. . Vertex prescribing infomation. , (2015).
- Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
- Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
- Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).
