Hinweis: Die minimalen Aufwand für dieses Protokoll ist 10.000 Zellen pro einzelne Immuno-Niederschlag (IP) Reaktion. Das mitgelieferte experimentelle Arbeitsblatt ausdrucken und als Richtlinie zu planen, das Experiment zu nutzen. Inkubationen bei Raumtemperatur werden als angenommen bei ~ 22 ° C. Alle Puffer Rezepte sind in Tabelle 1enthalten. Alle die Puffer sollten bei 4 ° C gelagert und hielt auf dem Eis während des Verfahrens, sofern nicht anders angegeben. 1. Zelle-Vorbereitung Kultivierten Zellen Waschen Sie die Zellen mit 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) und bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einer Hemocytometer genau zu. Wenn mehr als 1 Million Zellen vorhanden sind, erhöhen Sie die Lautstärke von PBS. Basierend auf die Zellzahl, aliquoten ein Äquivalent von 70.000-100.000 Zellen in einen sterilen 1,5 mL-Tube und Spin-down bei 500 X g für 6 min bei 4 ° C. Mit einer Pipette, langsam entfernen und entsorgen den überstand (ohne zu stören die Zelle Pellet) und erneut das Pellet in eiskalten Lyse Puffer + 1 x Proteaseinhibitor cocktail (Bild) zu einer Konzentration von 1.000 Zellen / µL. Mischen Sie gut durch pipettieren und ab 20-30 Zeiten. Es ist wichtig, dass die Zelle Klumpen gestört werden. Versuche nicht zu blasen. Gehen Sie direkt zu Tag1 (Abschnitt 2) von der NdChIP-Seq-Protokoll oder Blitz Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C. Sortierten Zellen 70.000-100.000 sortiert16 Zellen in einem 1,5 mL-Tube mit 350 µL Hank es gepufferte Salzlösung (HBSS) oder PBS + 2 % fetalen bovine Serum (FBS) sammeln. Spin-down jede Zelle aliquoten 500 X g für 6 min bei 4 ° C. Mit einer Pipette, langsam entfernen den überstand (ohne zu stören die Zelle Pellet) und Aufschwemmen im eiskalten Lyse Puffer + 1 x Bild, um eine Endkonzentration von 1.000 Zellen / µL. Mix gut in Lyse Puffer von oben und unten Pipettieren 20 – 30 Mal. Stellen Sie sicher, dass die Zelle Klumpen gestört werden. Versuche nicht zu blasen. Gehen Sie direkt zu Tag1 (Abschnitt 2) von der NdChIP-Seq-Protokoll oder Blitz Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C. 2. Tag 1: NdChIP-seq Vorbereitung des Antikörper-Bead-komplexes Bereiten Sie ein Wasserbad 37 ° C und einem Eiskübel. Arbeiten auf Eis, bereiten Sie 1 X IP Puffer/1 x PIC und 1 x Verdünnungspuffer Antikörper (Ab), und halten sie auf dem Eis. Rufen Sie Protein A (oder G) magnetische Beads (siehe Diskussion zu Auswahlkriterien ab) von 4 ° C Lagerung und Mischung sehr gut durch sanfte Puls-Bereich. Halten Sie es auf dem Eis.Hinweis: Puls-Bereich bedeutet, dass vortexen gestoppt wird, jedes Mal, wenn eine vollständige Wirbel in der Röhre entsteht. Übertragen Sie 24 µL Protein A (oder G) magnetische Beads pro IP-Reaktion in einer neuen 2-mL-Tube. Nehmen Sie das Volumen der Perlen auf und halten Sie das Rohr auf dem Eis. Zum Beispiel für 7 IPs verwenden 24 µL x 7 = 168 µL. Legen Sie das Rohr auf Rohr-Magnet und warten auf die Lösung klare Angabe Wulst Trennung zu werden. Ohne die Perlen sorgfältig den Überstand mit einer Pipette entfernen und entsorgen. Nehmen Sie das Rohr aus dem Rohr-Magnet und legen Sie es auf dem Eis. Fügen Sie ein gleiches Volumen (d.h. Ausgangsmenge von Perlen) der eiskalten IP-Puffer + 1 X PIC zu mischen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Tun Sie nicht Wirbel. Legen Sie die IP-Puffer + 1 x PIC + Perlen zurück auf die Rohr-Magnet und warten auf die Lösung klare Angabe Wulst Trennung zu werden. Ohne die Perlen sorgfältig den Überstand mit einer Pipette entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie kalt IP-Puffer + 1 X PIC waschen zwei weitere Male für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Perlen in ein gleiches Volumen (d.h. Ausgangsmenge von Perlen) der eiskalten IP-Puffer + 1 X PIC zu mischen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Tun Sie nicht Wirbel. Halten Sie das Rohr auf dem Eis. Gießen Sie auf dem Eis 10 mL IP-Puffer + PIC in ein 25 mL v-förmige Reservoir. Mit einer Mehrkanal-Pipette hinzufügen 130 µL eiskalte IP-Puffer + 1 x Bilder Mix in einzelnen Vertiefungen der eine saubere V-Boden-96-Well Platte. Füllen Sie einen Brunnen pro IP. Beschriften Sie die Platte als “Ab-Bead-Komplex”. 12 µL der gewaschenen Protein A (oder G) magnetische Beads in jeweils gut IP-Puffer + PIC einfügen und Mischen von Pipettieren rauf und runter. Halten Sie die restlichen gewaschenen Perlen auf dem Eis. Erhalten Sie validierte Antikörper aus ihre kühl- und Tauwetter auf Eis, falls erforderlich. Arbeiten auf Eis, verdünnen Sie die Antikörper mit 1 X Ab Verdünnungspuffer, die Konzentrationen, die in Tabelle 2dargestellt. Fügen Sie in jede Vertiefung der Ab-Bead komplexe Platte 1 µL der gegebenenfalls verdünnten Antikörper (Tabelle 1 hinzu). Notieren Sie den Brunnen auf den Antikörper-Schlüssel. Mit Mehrkanal-Pipette, jede Zeile durch Pipettieren nach oben und unten 20 Mal mischen. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Dichtplatte der Ab-Bead Komplex sehr gut mit einer Aluminium-Platte-Cover und inkubieren Sie bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform für mindestens 2 h.Hinweis: Diese Inkubation kann fortfahren, bis bereit, Schritt 2.4 zu beginnen. Lyse und Chromatin Verdauung Zelle Arbeiten auf Eis, 1 x Lyse Puffer + 1 x PIC und 1 mL MNase vorbereiten ich Verdünnung Puffer (Tabelle 3) und halten sie auf dem Eis. Rufen Sie die Zelle Pellets aus deren-80 ° C-Lagerung (oder Eis, wenn frisch zubereitet). Tauen Sie jede Zelle Pellet im Wasserbad 37 ° C für eine 10 s, dann Transfer zum Eis auf. Jede Zelle Pellet sofort fügen Sie eiskalte 1 x Lyse Puffer + 1 X Bild, um eine Endkonzentration von 10.000 Zellen/20 µL und Mix 10 Mal durch Pipettieren hoch und runter, ohne Luftblasen zu erstellen hinzu. Zum Beispiel ist das Endvolumen für 70.000 Zellen 140 µL. Arbeiten auf Eis, aliquoten 20 µL/Well von der daraus resultierenden Lysates in eine 96-Well-Platte. Die Abdeckplatte mit einem Kunststoff-Dichtung und brüten auf Eis für 20 min. Label die Platte “MNase Verdauung” und Aufzeichnen der Brunnen, ein Vorlage-Schlüssel. Um ein exaktes Timing der Chromatin Verdauung Reaktion zu gewährleisten, fahren Sie nicht auf die Verdauung mit mehr als 2 Reihen von Proben gleichzeitig. Kurz bevor die 20 min-Lyse abgeschlossen ist, verdünnen Sie die MNase ich Enzym mit MNase ich Verdünnung zu puffern, um eine Endkonzentration von 20 U/µL, und bewahren Sie es auf dem Eis. Arbeiten auf Eis, bereiten die MNase ich Verdauung-Mix entsprechend Tabelle 4 und aliquoten 20 µL pro jede Zeile der Proben plus 5 µL Totvolumen-Mix in einer Zeile einer 96-Well-Reservoir-Platte zu meistern und lassen Sie ihn auf Eis. Für zwei Reihen, das Laufwerk sollte: (20 µL 2) + 5 µL = 45 µL. Nachdem die Lysates Inkubation zu beenden, entfernen Sie die MNase Verdauung aus Eis. Mit einer Mehrkanal-Pipette 20 µL MNase hinzufügen ich Verdauung Mischung in jeder Zeile der Proben zu meistern, und mischen Sie 10 Mal von oben und unten pipettieren. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Bei genau 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 5 min um die Reaktion zu stoppen, mit Hilfe einer Mehrkanal-Pipette hinzu 6 µL 250 µM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in jeder Zeile der Proben und Mischen von oben und unten ein paar Mal. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Schalten Sie nach Zugabe von EDTA die Einstellung der Pipette 20 µL und Mischung 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter um einen völligen Stillstand der Verdauung Reaktion zu gewährleisten. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Mit einer Mehrkanal-Pipette, jede Zeile der MNase verdaut Proben fügen Sie 6 µL 10-fach Puffer lyse und Mix gut von oben und unten 10 Mal Pipettieren hinzu. Mit einer Kunststoffplombe decken Sie ab und inkubieren Sie für 15 min auf Eis. Eingabe Trennung und Pre-clearing Nach 15 min Inkubation, arbeiten auf Eis, Pool können alle Brunnen für die gleiche Pellet/Vorlage in eine sterile Zelle, auf Eis, 1,5 mL Tube (bereits mit der Vorlage ID beschriftet) und Mischung vorab gekühlt gründlich, aber langsam mit Hilfe einer Pipette Waschmittel Schäumen zu vermeiden. Übertragen Sie für jede Zelle Pellet/Vorlage 8 µL der verdauten Chromatin in eine neue sterile, 0,5 mL-Tube (bereits mit der Vorlage ID beschriftet) und Speicher bei 4 ° C über Nacht. Dies wird als das Eingabesteuerelement dienen. Verteilen Sie das restliche Volumen des verdauten Chromatin in 48 µL Aliquots in eine neue 96-Well-Platte. Pellet/Zellvorlage 1 geht in Vertiefungen A01-A06, Pellet/Zellvorlage 2 in Brunnen A07-A12 usw.geht. Notieren Sie die Brunnen zu einer Vorlage Schlüssel. Beschriften Sie die Platte “Pre-Clearing”. Mit einer Mehrkanal-Pipette, fügen Sie 120 µL 1 x IP-Puffer + 1 x PIC und 12 µL gewaschenen Protein A (oder G) magnetische Beads in jede Vertiefung der Pre-Clearing-Platte aus Schritt 2.3.3. Mischen Sie jede Zeile, indem Sie nach oben und unten 10 Mal pipettieren. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Die Dichtplatte sehr gut mit einer Aluminium-Platte-Cover und inkubieren Sie auf einer rotierenden Plattform bei 4 ° C für mindestens 2 h. Immunopräzipitation Reaktion Dieser Schritt vergewissern Sie sich vor, dass die Ab-Bead komplexe Platte (Schritt 2.1.10) und der Pre-Clearing-Platte (Schritt 2.3.4) inkubiert haben, für mindestens 2 h. Quick spin beide Platten durch Zentrifugieren für 10 s bei 200 X g. Die Ab-Bead komplexe Platte (aus Schritt 2.1.10) auf einem Teller Magnet und warten 15 s für die Lösung klar zu werden. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands mit einer Pipette ohne zu stören die Perlen. Entfernen Sie die Platte aus der Platte-Magnet und halten sie auf dem Eis. Die Pre-Clearing Reaktion Platte (aus Schritt 2.3.4) auf einem Teller Magnet und warten 15 s für die Perlen zu trennen und die Lösung klar zu werden. Übertragen Sie sorgfältig, ohne zu stören die Perlen, des Überstands mit einer Pipette in die entsprechenden Vertiefungen der komplexen Platte auf Eis und Mischung sanft 15 Mal gehalten, von oben und unten Pipettieren Ab-Sicke. Siegel die Platte gut mit Aluminium Platte Deckel und inkubieren Sie Übernachtung (12-18 h) bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform. Re-label die Platte “IP-Reaktion”. 3. Tag 2: NdCHIP-seq Waschungen und elution Einstellen des Heizung Mischers bis 65 ° C. Bereiten Sie auf dem Eis eine salzarme Waschpuffer und hohem Salzgehalt Waschpuffer. Schnelles drehen die IP-Reaktion Platte aus Schritt 2.4.3 für 10 s bei 200 X g. Die IP-Reaktion Platte auf einem Teller Magnet und warten 15 s für die Lösung klar zu werden. Mit einer Mehrkanal-Pipette, ohne zu stören die Perlen, sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands. Nehmen Sie die Platte aus der Platte Magnet und platzieren Sie es auf dem Eis. Jede Zeile der Proben in der IP-Reaktion Platte fügen Sie 150 µL des eiskalten salzarme waschen Puffer und Mischung langsam 10 Mal rauf und runter, um die Perlen voll aufzuwirbeln hinzu. Legen Sie die IP-Reaktion Platte wieder auf die Platte-Magnet, warten Sie, bis die Perlen zu trennen und mit einer Mehrkanal-Pipette, ohne zu stören die Perlen entfernen und entsorgen den überstand. Die Platte wieder auf Eis und wiederholen Sie die Schritte 3.1.3 und 3.1.4 für insgesamt 2 Wäschen. Jede Zeile der Proben in der IP-Reaktion-Platte auf dem Eis fügen Sie 150 µL des hohen Salz waschen Puffer und Mischung langsam 10 Mal von oben und unten, um die Perlen voll Aufschwemmen Pipettieren hinzu. Legen Sie die IP-Reaktion Platte wieder auf die Platte-Magnet, warten Sie, bis die Perlen zu trennen und mit einer Mehrkanal-Pipette, ohne zu stören die Perlen entfernen und entsorgen den überstand. Die IP-Reaktion Platte auf dem Eis und chill bereits eine neue 96-Well-Platte daneben. Jede Zeile der Proben in der IP-Reaktion Platte fügen Sie 150 µL des hohen Salz waschen Puffer und Mischung langsam 10 Mal von oben und unten, um die Perlen voll Aufschwemmen Pipettieren hinzu. Übertragen Sie nach Wiederfreisetzung jede Zeile der Proben auf die entsprechende Zeile der neuen, vorgekühlt, 96-Well-Platte. Beschriften Sie die Platte “IP-Reaktion”. Entsorgen Sie die alte Platte. Die neue IP-Reaktion Platte auf den Teller-Magneten und warten Sie, bis die Perlen zu trennen. Mit einer Mehrkanal-Pipette, ohne zu stören die Perlen, sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands. Die Platte bei Zimmertemperatur aufbewahren. An jede Zeile von Proben in der IP-Reaktion Platte 30 µL des Puffers ChIP Elution (EB) und mischen Sie langsam 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Achten Sie darauf, um Blasenbildung zu vermeiden. Die Dichtplatte mit einer PCR-Abdeckung und in einem Mischer Heizung bei 65 ° C für 1,5 h mit einer Geschwindigkeit von 1.350 u/min inkubieren. Nach 1,5 h Inkubation spin-down der IP-Reaktion Platte 200 X g für 1 min bei 4 ° C. Ändern Sie die Einstellung des Mischers Heizung bis 50 ° C. Nach dem Dreh die IP-Reaktion Platte auf einem Teller Magnet und warten Sie, bis die Lösung klar. Mit einer Mehrkanal-Pipette, stören die Perlen sorgfältig übertragen Sie, ohne 30 µL des Überstands in eine neue 96-Well-Platte. Verwenden Sie frische Tipps für jede Zeile. Beschriften Sie die Platte “IP-Reaktion” und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Proteinverdauung 30 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst17 (Zusammensetzung Puffertisch) Lösung von 4 ° C Kühlschrank abrufen und halten Sie sie bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten kritische: sicherzustellen, dass die Perle-Lösung vollständig Raumtemperatur bevor Sie fortfahren. Eingabesteuerelement Proben von 4 ° C Lagerung (Schritt 2.3.2) und schnelle Runde abzurufen. Messen Sie das Volumen mit einer Pipette und Reinstwasser jedes Eingabesteuerelement einem Endvolumen von 30 µL. Weitergabe Eingabesteuerelement Proben in die vorgewählten Eingabe Vertiefungen (leeren Brunnen) auf Hinzufügen der IP-Reaktion Platte (Schritt 3.1.12). Notieren Sie den Brunnen auf den Probe-Schlüssel. Auf dem Eis vorbereiten der Protein-Verdauung-Master-Mix wie in Tabelle 5 und aliquoten gleiches Volumen in einer Zeile einer 96-Well-Reservoir-Platte gezeigt. Mit einer Mehrkanal-Pipette, um jede Zeile der Proben in der IP-Reaktion Platte 40 µL der Protein-Verdauung-Master-Mix und mischen Sie langsam 10 Mal rauf und runter. Die Dichtplatte mit einer PCR-Abdeckung, spin-down bei 200 X g für 1 min und brüten in einem Mischer Heizung bei 50 ° C für 30 min. bei 650 u/min eingestellt. Während die Platte Inkubation ist, bereiten Sie frische 70 % igem Ethanol (EtOH) und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Nach 30 min Inkubation abgeschlossen ist, drehen Sie die IP-Reaktion Platte 200 X g für 1 min, 4 ° C. Die Platte bei Zimmertemperatur aufbewahren.Hinweis: Das Gesamtvolumen sollte jetzt ~ 70 µL/Well. Perle-Bereinigung mit 30 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung Aliquoten Raumtemperatur 30 % PEG/1 M NaCl magnetic bead Lösung in einer Zeile einer Behälter sauber 96-Well-Platte (75 µL pro Probe x Anzahl der Zeilen). Arbeiten bei Raumtemperatur mit einer Mehrkanal-Pipette, jede Zeile der Proben in der IP-Reaktion Platte 70 µL (Verhältnis 1:1) die 30 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung hinzu und mischen Sie 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Inkubieren Sie die Platte für 15 min bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte auf den Teller-Magneten und inkubieren Sie für 5 min um die Perlen zu trennen lassen. Mit einer Pipette, ohne zu stören die Perlen, sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands. Halten Sie die Perlen. Während die IP-Reaktion Platte immer noch auf der Platte-Magnet ist, mit einer Mehrkanal-Pipette, um jede Zeile der Proben, hinzufügen 150 µL Raumtemperatur 70 % EtOH und inkubieren Sie für 30 s. Nach 30 s, mit einer Mehrkanal-Pipette entfernen und entsorgen den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen. Brüten Sie nach der zweiten Wäsche EtOH die “trockene” Platte auf den Teller-Magneten für 3 min. Sichtprüfung die Platte, um sicherzustellen, dass alle EtOH verdampft wird. Ist dies nicht der Fall, brüten die Platte für 1 min. über Trocknung der Perlen resultiert eine geringere Ausbeute. Fügen Sie die Platte aus der Platte-Magnet und mit einer Mehrkanal-Pipette nehmen 35 µL EB (Table of Materials). Mischen Sie gut durch Pipettieren 10 Mal rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Inkubation bei Raumtemperatur 3 min zu eluieren. Nach der Inkubation die IP-Reaktion Platte wieder auf die Platte-Magnet und 2 min inkubieren. Die Perlen sollten trennen und die Lösung wird klar. Mit einer Mehrkanal-Pipette, stören die Perlen sorgfältig übertragen Sie, ohne Überstand in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte. Dichtplatte mit einer Aluminium-Platte-Cover, label “IPed + Eingabe DNA” und speichern bei 4 ° C über Nacht oder bei-20 ° C für längere Zeit (> 48 h) Speicher. 4. Tag 3: Bibliotheksbau Ende Reparatur- und Phosphorylierung Der Eingang für die Ende Reparatur/Phosphorylierung Reaktion ist das IPed + Eingang Platte aus Schritt 3.3.10. Nach dem Auftauen mit 200 X g für 1 min bei 4 ° C drehen Sie, die Platte nach unten und halten sie auf dem Eis. Abrufen von-20 ° C Gefrierschrank aller Reagenzien (mit Ausnahme von Enzymen) erforderlich für die Ende Reparatur/Phosphorylierung Reaktion (Tabelle 6) und bei Zimmertemperatur auftauen, dann sofort um zu Eis übertragen. Arbeiten auf Eis, folgen Sie Tabelle 6 Ende Reparatur/Phosphorylierung Master Mix in einem sterilen, 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einrichten. Mischen Sie nach der Zugabe von allen nicht-Enzym Bestandteile gut durch Puls-Bereich und setzen Sie den Schlauch wieder auf Eis. Die entsprechenden Enzyme aus ihrer kalten Lagerung und Transport auf der Bank in einem gekühlten Rohr cool Rack abrufen. Mischen Sie jedes Enzym durch Streichen der Tube, schnelle Runde, und legen Sie sie zurück in den gekühlten Rohr cool Rack. Wenn das Enzym pipettieren, aspirieren Sie langsam um eine genaue Volumen-Transfer zu gewährleisten. Waschen Sie nach der Zugabe die Spitze in den master-Mix durch Pipettieren rauf und runter. Sobald die Enzyme hinzugefügt werden, zurück sanft Puls-Vortex Master mix 5mal zu gewährleisten eine gleichmäßige Verteilung der Komponenten, dann die schnelle Runde und sofort den Schlauch auf dem Eis. Auf dem Eis, aliquoten einem entsprechenden Volumen des Ende Reparatur/Phosphorylierung Master-Mix in einer Zeile eine neue Reservoir 96-Well-Platte; Volume regelmÄÑig: (15 µL x Anzahl der Zeilen) + 5 µL Totvolumen. Eine Beispielrechnung für zwei Zeilen: (15 µL 2) + 5 µL = 35 µL/Well. Mit einer Mehrkanal-Pipette, jede Zeile der Proben 15 µL Ende Reparatur/Phosphorylierung Master Mix hinzu und mischen Sie 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Die Dichtplatte mit einer Kunststoff-Abdeckung, spin-down bei 200 X g für 1 min bei 4 ° C und bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren. Wulst Aufräumarbeiten nach Ende Reparatur- und Phosphorylierung Aus dem Kühlschrank 4 ° C die PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung 20 % und 30 % PEG/1 M NaCl-Lösung abgerufen und bei Zimmertemperatur mindestens 30 min inkubieren.Hinweis: Die 30 % PEG/1 M NaCl-Lösung nicht enthalten magnetische Beads. Nachdem beide Lösungen Raumtemperatur erreicht haben, für jede Probe bereiten Sie 80 µL 1:2 Mischung aus 30 % PEG/1 M NaCl und 20 % PEG/1 M NaCl-magnetischer Wulst-Lösungen. Ein Beispiel für 24 Proben: 80 µL x 24 = 1.920 µL (640 µL 30 % PEG/1 M NaCl und 1.288 µL 20 % PEG/1 M NaCl-magnetischer Wulst-Lösungen). Aliquoten die Wulst Lösung mischen, gleiches Volumen in einer Zeile einer 96-Well-Reservoir-Platte und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Aliquoten EB-Puffer (40 µL pro Probe x Anzahl der Zeilen) in einer Zeile einer Behälter sauber 96-Well-Platte. Ein Beispiel für zwei Reihen: 40 µL x 2 = 80 µL/Well. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 75 µL der Perle Mischung vorbereitet jede Zeile der Proben aus Schritt 4.1.7 4.2.2 betreten und nach oben und unten 10 Mal mischen. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. weiter mit dem Wulst-Bereinigung-Verfahren beschriebenen Schritte 3.3.3-3.3.10. Die Platte mit einer Kunststoffplombe, schnelle Runde abdecken und auf Eis legen. Fahren Sie mit Schritt 4.3. A-Tailing Reaktion Abrufen von-20 ° C Gefrierschrank alle Reagenzien (mit Ausnahme von Enzymen) für die A-Tailing Reaktion (Tabelle 7) erforderlich, bei Raumtemperatur auftauen dann sofort um zu Eis übertragen. Folgen Sie arbeiten auf Eis, Tabelle 7 , A-Tailing Master Mix in einem sterilen, 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einzurichten. Folgen Sie die allgemeine enzymatische Gebräu Installationsanweisungen beschriebenen Schritte 4.1.4-4.1.6. Mit einer Mehrkanal-Pipette, jede Zeile der Proben 15 µL des A-Tailing Master Mix hinzu und mischen Sie 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Die Dichtplatte mit einer PCR-Abdeckung und spin-down bei 200 X g für 1 min bei 4 ° C in einem Thermocycler bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Nach der Inkubation mit 200 X g für 1 min drehen Sie, die Platte nach unten und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Wulst Aufräumarbeiten nach A-Tailing Führen Sie die Schritte in Schritt 4.2 beschrieben. Die Abdeckplatte mit Kunststoffdichtung, Label “A-Tail + BC”, schnelle Runde, und legen Sie es auf dem Eis. Fahren Sie mit Schritt 4.5. Adapter-Ligatur Abrufen von-20 ° C Gefrierschrank alle Reagenzien (mit Ausnahme von Enzymen) für die Adapter-Ligatur-Reaktion (Tabelle 8) erforderlich, bei Raumtemperatur auftauen dann sofort um zu Eis übertragen. Abrufen von 10 µM PE-Adapter (Supplemental Tabelle1) Stammlösung und verdünnen auf 0,5 µM mit EB. Mischen Sie gut durch Puls aufschütteln. Die benötigte Menge ist 3 µL x Anzahl der Proben. Arbeiten auf Eis, aliquoten 0,5 µM PE-Adapter, gleiches Volumen in 12 Vertiefungen einer Behälter sauber 96-Well-Platte. Halten Sie es auf dem Eis. Folgen Sie arbeiten auf Eis, Tabelle 8 , um den Adapter Ligation Master-Mix in einem sterilen, 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einzurichten. Folgen Sie die allgemeine enzymatische Gebräu Installationsanweisungen beschriebenen Schritte 4.1.4-4.1.6. Stellen Sie sicher, dass die 5 X schnelle Ligation Puffer vollständig aufgetaut und vor Gebrauch gut gemischt ist. Auf dem Eis, aliquoten einem entsprechenden Volumen des Adapter-Ligation-Master-Mix in einer Zeile eine neue Reservoir 96-Well-Platte. Zum Beispiel Berechnung für zwei Zeilen: (23 µL 2) + 5 µL = 51 µL/Well. Halten Sie die Platte auf dem Eis. Mit einer Mehrkanal-Pipette, fügen Sie 2 µL 0,5 µM gepaart Ende (PE) Adapter in jede Zeile der Proben aus Schritt 4.4.1 und Mix. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Mit einer Mehrkanal-Pipette, jede Zeile der Proben 23 µL Adapter Ligation Master Mix hinzu und mischen Sie 15 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Die Dichtplatte mit einem Metalldeckel, Label “Ligatur” Spin-down bei 200 X g für 1 min bei 4 ° C und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Tag: Bead Aufräumarbeiten #1 nach Adapter Ligatur Aus dem Kühlschrank 4 ° C 20 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung abrufen und bei Zimmertemperatur mindestens 30 min inkubieren. Während die Lösung Äquilibrierung ist bereiten frisch 70 % EtOH. Aliquoten 20 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung, 55 µL pro Probe in einer Zeile eines Reservoirs 96-Well Platte und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Ein Beispiel für zwei Reihen: 55 µL x 2 = 110 µL/Well. Aliquoten EB Puffer, 50 µL pro Probe in eine Zeile einer Behälter sauber 96-Well-Platte. Ein Beispiel für zwei Reihen: 50 µL x 2 = 100 µL/Well. Mit einer Mehrkanal-Pipette, 48 µL 20 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung in jeder Zeile der Proben in der Ligatur-Platte aus Schritt 4.5.6 und mischen nach oben und unten 10 Mal. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. weiter mit dem Wulst-Bereinigung-Verfahren beschriebenen Schritte 3.3.3-3.3.7. Fügen Sie die Platte aus der Platte-Magnet und mit einer Mehrkanal-Pipette nehmen 45 µL EB (Table of Materials). Mischen Sie gut durch Pipettieren 10 Mal rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Bei Raumtemperatur für 3 min zu eluieren inkubieren. Nach der Inkubation die IP-Reaktion Platte wieder auf die Platte-Magnet und inkubieren 2 min. mit einer Mehrkanal-Pipette, ohne zu stören die Perlen, überstand vorsichtig in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte zu übertragen. Beschriften Sie die Platte “Ligatur + 1 BC”. Fügen Sie in jede Vertiefung 5 µL 10 X PCR High-Fidelity Puffer hinzu und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Die Abdeckplatte mit Kunststoffdichtung, schnelle Runde und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Perle-Bereinigung #2 nach Adapter Ligatur Perle-Bereinigung durchführen, wie beschrieben in Abschnitt 4.6 mit folgenden Änderungen: 60 µL 20 % PEG/1 M NaCl magnetischer Wulst Lösung für jedes aktive gut in der Ligatur + 13:00-Platte (Schritt 4.6.7) hinzufügen und aus den Perlen mit 35 µL EB Puffer eluieren. Beschriften Sie die Platte “Ligatur + 2 BC” und halten sie auf dem Eis. PCR-Amplifikation Abrufen aus dem Tiefkühler-20 ° C alle Reagenzien (mit Ausnahme von Enzymen) für die PCR-Reaktion (Tabelle 9) erforderlich, bei Raumtemperatur auftauen dann sofort auf Eis legen. Arbeiten auf Eis, folgen Sie Tabelle 9 die PCR Master-Mix in einem sterilen, 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einrichten. Folgen Sie der allgemeinen Gebräu Aufstellanleitung beschriebenen Schritte 4.1.4-4.1.5. Auf dem Eis, aliquoten einem entsprechenden Volumen des PCR-Master-Mix in einer Zeile eine neue Reservoir 96-Well-Platte. Halten Sie es auf dem Eis. Siehe Schritt 4.5.4 für Beispielrechnungen. Arbeiten auf Eis, mit einer Mehrkanal-Pipette, 2 µL jeder einzigartige 12,5 µM PCR reverse Indexierung Grundierung (Supplemental Tabelle 2) in jedem Brunnen in der Ligatur + 2 v. Platte (Schritt 4.7.1) und mischen Sie langsam rauf und runter. Tipps zwischen den Zeilen zu ändern. Halten Sie die Platte auf dem Eis. Arbeiten auf Eis, mit einer Mehrkanal-Pipette hinzufügen 23 µL des PCR-master-Mix in jeder Zeile von Proben aus Schritt 4.8.3 und Mix 10 Mal durch Pipettieren rauf und runter. Dichtplatte mit einer PCR-Abdeckung, 200 X g für 1 min nach unten zu drehen und in einem Thermocycler inkubieren (siehe Tabelle 10 für PCR-Radsport-Zustände). Wulst Aufräumarbeiten nach PCR Verstärkung Drehen Sie nach der PCR-Amplifikation die Platte 200 X g für 1 min, 4 ° C. Die Perle Bereinigung durchführen, wie beschrieben in Abschnitt 4.6 mit folgenden Änderungen: jeder PCR-Reaktion 51 µL 20 % PEG/1 M NaCl-magnetischer Wulst-Lösung hinzu und eluieren von die Perlen mit 25 µL EB Puffer. Die Dichtplatte mit einem Aluminium-Deckel und spin-down bei 200 X g für 1 min. Store die Proben bei-20 ° C. Zur Überprüfung konstruierter Bibliotheken durchführen DNA Quantifizierung mit Hilfe einer Fluoreszenz basierende Assays, visualisieren das Endprodukt mit einem Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Analysator (hohe Empfindlichkeit Assay) und Bereicherung führen quantitative PCR (qPCR) (siehe Vertreter Resultate, NdChIP-Seq Bibliothek Qualitätssicherung durch qPCR).