Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Summary

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Abstract

De hervorming van het celmembraan is een integraal onderdeel van vele cellulaire fenomenen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, enz. Veel verschillende eiwitten associëren met een gebogen membraan omwille van hun vermogen om zin of induceren membraan kromming. Deze processen zijn gewoonlijk een veelheid aan eiwitten waardoor ze te ingewikkeld om te studeren kwantitatief in de cel. We beschrijven een protocol om te reconstrueren een gebogen membraan in vitro, het nabootsen van een gebogen cellulaire structuur, zoals de endocytotische nek. Een gigantische unilamellar blaasje (GUV) wordt gebruikt als een model van een celmembraan, waarvan de interne druk en oppervlaktespanning worden geregeld met micropipet streven. Een punt trekken kracht toe te passen op de GUV met optisch pincet creëert een nanobuis hoge kromtestraal verbonden met een platte membraan. Deze methode heeft van oudsher gebruikt voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van lipide membranen, zoals het buigen van stijfheid. In de afgelopen jaren heeft het uitgebreid bestuderen hoe eiwitten interactie met membraan kromming en de manier waarop zij invloed op de vorm en de mechanica van membranen. Een combinatie van micromanipulation, microinjection, optisch pincet en confocale microscopie systeem maakt meting van membraan kromming, membraan spanning, en de oppervlakte dichtheid van eiwitten, gelijktijdig. Uit deze metingen, kunnen vele belangrijke mechanische en morfologische eigenschappen van de eiwit-membraan systeem worden afgeleid. Bovendien, lay we-out een protocol voor het maken van GUVs in aanwezigheid van fysiologische zoute concentratie en een methode voor de kwantificering van de oppervlakte dichtheid van eiwitten op het membraan van de intensiteit van de fluorescentie van gelabelde proteïnen en lipiden.

Introduction

Veel cellulaire processen, zoals endocytose, mensenhandel, de vorming van filopodia, infectie, enz., worden begeleid door een dramatische verandering in de vorm van celmembranen^1,2. In de cel deelnemen een aantal eiwitten aan deze processen door te binden aan het membraan en veranderen hun vorm. De opmerkelijkste voorbeelden behoren tot de familie van de Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) eiwit, met een karakteristiek intrinsiek gebogen BAR domein^3,4,5,6,7. Typisch, ze interageren met het membraan door het domein van de BAR aan de oppervlakte en, in veel gevallen ook ondiep invoegen amphipathic helices in de dubbelgelaagde vast te houden. De vorm, grootte en kosten van het domein van de BAR samen met het aantal amphipathic helices bepaalt: (1) de richting van membraan kromming (d.w.z., of zij zal induceren invaginations of uitsteeksels), en (2) de omvang van het membraan kromming^5,8. Van de nota, is hier positieve kromming gedefinieerd als de convexe kant van het gebogen membraan, dat wil zeggen, de Ardennen richting de interagerende deeltjes, en negatieve anders. Bovendien, kwantitatieve studies van BAR eiwitten bleek dat hun effect op het membraan hangt af van een aantal fysieke parameters: dichtheid van eiwitten, membraan spanning en membraan vorm (platte versus buisvormige versus sferisch oppervlak vorm)⁷. Afhankelijk van deze parameters BAR eiwitten kan: (1) fungeren als sensoren van membraan kromming, (2) buigen membranen of (3) induceren membraan splitsing⁷.

Vanwege het enorme aantal onderdelen die betrokken zijn bij het membraan omvormen in de cel, het bestuderen van de kwantitatieve aspecten van de verschijnselen, zoals endocytose, is in vivo zeer uitdagend. In vitro reconstitutie van minimale onderdelen nabootsen van gebogen membranen in de cel de mogelijkheid biedt een mechanistische begrip van hoe membraan-gebogen eiwitten werken te krijgen. Dit artikel beschrijft een protocol om te reconstrueren een membraan nanobuis in vitro met micromanipulation, confocal microscopie en optisch pincet. De aanpak kan worden gebruikt om te studeren, op een kwantitatieve manier, eiwitten, lipiden, of kleine moleculen interactie met een gebogen membraan. Lipide-GUVs worden gebruikt als model van een celmembraan, waarvan de kromming te verwaarlozen in vergelijking met de grootte van interagerende membraan-gebogen moleculen is. Ze zijn bereid met behulp van de electroformation methode⁹ waarin de blaasjes worden gevormd door een lipide-film hydraterende en zwelling het in GUVs onder een wisselstroom (AC)¹⁰. Meest voorkomende ondergronden waarop GUVs worden geteeld zijn beide semi-geleidend platen bedekt met indium tin oxide (ITO) of platina draden (Pt-draden)¹¹. In dit werk worden GUVs gekweekt op Pt-draden zoals deze methode gebleken te werken veel beter dan het alternatief bij het maken van GUVs in aanwezigheid van zouten in de buffer¹². Hoewel het electroformation-protocol hier in voldoende detail beschreven wordt te reproduceren, verwijzen we de lezer naar eerdere artikelen waarin vergelijkbare en andere methoden van het maken van GUVs zijn beschreven in detail^13,14. In onze handen, heeft electroformation op Pt-draden met succes opgeleverd GUVs uit een mix van synthetische lipiden of uit natuurlijke lipide extracten in een buffer met ~ 100 mM NaCl. Bovendien was het ook mogelijk om in te kapselen eiwitten binnen GUVs tijdens groei. Een kamer van de electroformation in het volgende voorbeeld wordt getoond in figuur 1A; het bestaat uit twee ~ 10-cm lange Pt-draden ingevoegd in een houder gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE) dat kan worden verzegeld aan beide zijden met glas coverslips ~ 1-2 cm uit elkaar (figuur 1A).

Figuur 1: experimentele opzet. (A) de GUV-electroformation kamer met elektrische aansluitingen op Pt-draden aangesloten. (B)-links: de experimenteel systeem tonen de Microscoop, de experimentele kamer boven de doelstelling en twee micropipetten (links en rechts) aan de micromanipulators en ingevoegd in de experimentele zaal voor buis trekken en eiwit injectie. Rechts: een vergrote weergave van de experimentele kamer gemonteerd boven de doelstelling met de toppen van de ambitie en de injectie micropipetten ingevoegd. (C) A injectiespuit voorzien van een dunne dispenser ingevoegd in een micropipet op de back-end. De onderkant is een vergrote weergave van de dispenser binnen de micropipet met de blauwe stippellijn overzichten van de micropipet. Dit systeem wordt gebruikt voor het vullen van de micropipet met caseïne om te passivate het glasoppervlak en ook om opvulling met minerale olie wanneer nodig. (D) een systeem gebruikt om µL hoeveelheden van de eiwit-oplossing gecombineerd. De naald is verbonden aan een injectiespuit en slang die is aangesloten op de micropipet van de injectie. De micropipet tip is zorgvuldig ondergedompeld in de eiwit-oplossing en aanzuiging dus om te vullen de micropipet tip. De micropipet is vervolgens weer gevuld met minerale olie met behulp van het systeem dat is afgebeeld in deelvenster C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Een membraan nanobuis, variërend in straal van 7 nm tot enkele honderden nm, bij een GUV kan worden opgevraagd door een externe kracht. Deze methode was in eerste instantie bedoeld voor het meten van de elastische eigenschappen van celmembranen en blaasjes, zoals de buigende stijfheid^15,16. In de meest recente producties, werd de methode uitgebreid bestuderen de interactie van eiwitten met een gebogen membraan door de eiwitten in de buurt van de getrokken nanobuis^7,17microinjecting. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de membraan-gebogen eiwitten. In één methode, worden eiwitten geïncubeerd met verschillend formaat liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak. Confocale microscopie wordt gebruikt voor het meten van de binding aan eiwitten als een functie van liposoom diameter, die kromming-geïnduceerde sorteren^18,19kunt aangeven. Een andere methode, worden eiwitten geïnjecteerd in de buurt van een micro-aanzuiging GUV voor het meten van hun vermogen om spontaan induceren tubuli^20,21. De in dit protocol beschreven methode is uniek geschikt om te studeren membraan-gebogen eiwitten die betrokken zijn in endocytose, waar de meeste eiwitten meestal tegenkomen voorgevormde membraan nanotubes aansluiten van de lading-bevattende membraan-invagination met de onderliggende platte plasma membraan. Bovendien, in deze methode, in tegenstelling tot in de test met vastgebonden kleine liposomen, het membraan nanobuis is voortdurend in verbinding staan op het membraan; Daarom is het in mechanisch evenwicht met de GUV, een situatie verwacht in vivo. Vandaar, fundamentele membraan Natuurkunde geldt en we kunnen een overvloed aan mechanische eigenschappen afleiden uit onze metingen^22,23,24.

Voor een volledige implementatie van deze methode omvat de benodigde apparatuur een confocal microscoop, optisch pincet en één of twee micropipetten, aangesloten op een waterreservoir (figuur 1B). Door de combinatie van alle drie, kan men meten membraan spanning, membraan kromming, oppervlakte dichtheid van eiwitten en tegelijkertijd tube kracht²⁵. Micropipet aspiratie is essentieel en het gemakkelijk is gebouwd door het invoegen van een glazen micropipet in een houder die is aangesloten op een waterreservoir, dat via de hydrostatische druk, de aspiratie druk^{26 controleert}. De micropipet en de houder worden gecontroleerd door een micromanipulator en, idealiter in één richting door een piezo-actuator voor precisie beweging. Te trekken een nanobuis, de GUV is kort vast aan een micron-en kleinbedrijf kraal vervolgens trok weg het creëren van een nanobuis microaspirated. In deze uitvoering, wordt de parel gehouden door optisch pincet, die kan worden geconstrueerd door het volgen van een gepubliceerde protocol²⁷. Het is mogelijk af te zien van de optisch pincet en pull nanotubes op verschillende manieren, hoewel ten koste van nauwkeurige kracht metingen. Als het is ook uitdagend om te bouwen van een optische trap of als kracht metingen zijn niet onontbeerlijk, zoals men wil gewoon om te controleren de voorkeur van eiwitten voor gebogen membranen, een buis kan worden getrokken met behulp van een kraal aanzuiging op het puntje van een tweede micropipet²⁸. Het is ook mogelijk voor het trekken van buizen met behulp van de zwaartekracht²⁹ of^30,31te stromen. Bovendien is confocale microscopie niet noodzakelijk echter bij voorkeur wordt dus voor het meten van de oppervlakte dichtheid van eiwitten. Het maakt het ook mogelijk de nanobuis straal van intensiteit van de fluorescentie van lipiden in de buis, dus onafhankelijk van de membraan kracht en spanning te meten. Afgeleid van buis straal van fluorescentie is vooral belangrijk als de relatie tussen deze hoeveelheden van de gevestigde vergelijkingen als gevolg van de aanwezigheid van eiwitten membraan-nageleefd^{25 afwijkt}. Nog belangrijker is, kan niet een afzien van zowel de optische val en confocale microscopie, zoals het zal niet mogelijk zijn om te meten de kromming van de buis.

De methode zoals beschreven in dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de kromming-geïnduceerde sorteren van verschillende perifere membraaneiwitten op nanobuisjes, vooral degenen uit de BAR familie^25,32,33,34 . Het was ook te zien dat het kanaal van de conically gevormde transmembraan kalium dat kvap wordt verrijkt op gebogen nanotubes op dezelfde manier als BAR eiwitten³⁵. Door het optimaliseren van de methode voor het inkapselen van eiwitten binnen GUVs, is de interactie van eiwitten met negatieve kromming onlangs onderzocht als goed³⁶. Bovendien, deze methode is gebruikt te verhelderen van de vorming van eiwitten steigers^25,37 en te bestuderen van het mechanisme van membraan splitsing door ofwel lijn spanning³⁸, eiwit dynamin³⁹, of door BAR eiwitten^40,41. Naast eiwitten, kunnen kleine moleculen of ionen ook veroorzaken kromming. Met deze methode werden calciumionen getoond voor het opwekken van positieve kromming onder voorwaarden zoutloos⁴². Interessant, is het ook aangetoond dat lipiden kromming sorteren, hoewel alleen voor composities die in de buurt van een demixing punt^{43,44 zijn}kunnen ondergaan. Kortom, de methode kan worden gebruikt door onderzoekers kochten onderzoeken hoe beide integraal membraan componenten (bv, lipiden of transmembraan eiwitten) of ook bindende moleculen (hetzij binnen of buiten GUVs) ermee cilindrische gebogen membranen, uit oogpunt van mechanische en kwantitatieve. Het is ook bedoeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het meten van de mechanische eigenschappen van het membraan zich^22,23,45.

Protocol

1. bereiding van GUVs door Electroformation op Pt-draden Schoonmaken van de kamer van electroformation (Zie Inleiding en figuur 1A) en de Pt-draden met een organische oplosmiddelen zoals ethanol of aceton om weg te wassen de lipiden en met water weg te wassen de zouten.Opmerking: We raden grondig veegde weg het residu met ethanol doordrenkte weefsel dan sonicating in aceton, ethanol, dan water, elk gedurende 5 minuten. Bereiden een lipide mix van een …

Representative Results

Het experiment van buis-pulling kan geven essentiële mechanische informatie over het membraan. Bij gebrek aan eiwitten of andere moleculen die paar met membraan kromming, het membraan dwingen en straal van de buis kan worden gerelateerd met membraan spanning door het toepassen van de Hamiltoniaan boekje-Helfrich vergelijking tot een koker getrokken uit een GUV50,51 <im…

Discussion

De methode van het trekken van buizen van GUVs geeft rijke informatie op het membraan-eiwit-systeem, maar het is niet alleen de middelen voor het meten van de fundamentele mechanische eigenschappen van het membraan, helpt het om licht werpen op de koppeling tussen eiwitten en membraan kromming. Zoals besproken in de inleiding, andere technieken bestaan voor het meten van de effecten van membraan-gebogen eiwitten, door de eiwitten aan het broeden met sub micron liposomen vastgebonden aan een speciaal oppervlak<sup class="…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5