Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

Summary

Beaucoup de protéines dans la cellule détecte et induire la courbure de la membrane. Les auteurs décrivent une méthode pour extraire des nanotubes de la membrane de vésicules lipidiques pour étudier l’interaction des protéines ou de n’importe quelle molécule de courbure-active avec courbes de membranes in vitro.

Abstract

Le remodelage de la membrane cellulaire est partie intégrante de nombreux phénomènes cellulaires, tels que l’endocytose, le trafic, la formation des filopodes, etc.. Nombreuses protéines différentes associent à membranes courbés à cause de leur capacité à détecter ou induire la courbure de la membrane. En règle générale, ces processus impliquent une multitude de protéines, ce qui les rend trop complexe à étudier quantitativement dans la cellule. Les auteurs décrivent un protocole afin de reconstituer une courbe membrane in vitro, imitant une structure cellulaire courbée, comme le cou d’endocytose. Une vésicule unilamellaires géant (GUV) est utilisée comme un modèle d’une membrane de la cellule, dont la pression interne et la tension superficielle sont contrôlé avec aspiration de la micropipette. Application d’une force de traction de point sur le GUV à l’aide de pinces optiques crée un nanotube de courbure élevé lié à une membrane plate. Cette méthode a traditionnellement été utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques fondamentales des membranes lipidiques, tels que la rigidité de flexion. Ces dernières années, il a été élargi pour étudier comment les protéines interagissent avec la courbure de la membrane et la manière dont ils affectent la forme et la mécanique des membranes. Un système combinant micromanipulation, micro-injection, pinces optiques et la microscopie confocale permet la mesure de la courbure de la membrane, la tension de la membrane et la masse surfacique des protéines, simultanément. Ces mesures, de nombreuses propriétés importantes de mécaniques et morphologiques du système protéine membranaire peuvent être déduites. En outre, nous posons un protocole de création GUVs en présence de concentration saline physiologique et une méthode de quantification de la masse surfacique des protéines sur la membrane des intensités de fluorescence des lipides et des protéines marquées.

Introduction

Nombreux processus cellulaires, tels que de l’endocytose, le trafic, la formation des filopodes, infection, etc., sont accompagnées d’un changement radical dans la forme de membranes cellulaires^1,2. Dans la cellule, un certain nombre de protéines participer à ces processus en se liant à la membrane et modifier leur forme. Les exemples les plus notables sont membres de la famille des protéines amphiphysine/Bin/Rvs (BAR), contenant une caractéristique intrinsèque courbée BAR domaine^3,4,5,6,7. En général, ils interagissent avec la membrane en respectant le domaine de BAR à la surface et, dans bien des cas, également très superficiellement insertion amphipathic hélices dans la bicouche. La forme, la taille et frais du domaine BAR ainsi que le nombre de spirales d’amphipathic détermine : (1) le sens de courbure de la membrane (c.-à-d., si ils vont induire des invaginations ou saillies) et (2) l’ampleur de la membrane courbure de^5,8. À noter ici courbure positive est définie comme la partie bombée de la membrane courbée, c’est-à-dire, le renflement vers la particule qui interagissent et négatif sinon. En outre, des études quantitatives des barres protéines ont révélé que leur effet sur la membrane dépend d’un ensemble de paramètres physiques : grammage de protéines, la tension de la membrane et forme de membrane (plat contre tubulaire versus sphérique ⁷de forme). Selon ces paramètres BAR protéines peut : (1) agissent comme capteurs de courbure de la membrane, (2) Pliez les membranes ou (3) induisent la membrane scission⁷.

En raison de la multiplicité des composants impliqués dans la membrane remodeler dans la cellule, étudie les aspects quantitatifs des phénomènes, tels que l’endocytose, in vivo est extrêmement difficile. In vitro la reconstitution des éléments minimes imitant les membranes courbés dans la cellule permet d’acquérir une compréhension mécaniste des protéines de membrane-cintrage comment exploiter. Cet article décrit un protocole afin de reconstituer une membrane nanotube in vitro avec micromanipulation, microscopie confocale et pinces optiques. L’approche permet d’étudier, de manière quantitative, comment les protéines, lipides ou des petites molécules interagissent avec membranes incurvés. GUVs lipides sont utilisés comme modèles d’une membrane de la cellule, dont la courbure est négligeable par rapport à la taille des molécules interagissants de membrane-courber. Ils sont préparés à l’aide de la méthode d’electroformation⁹ dans lequel les vésicules sont formées par hydratant un film lipidique et ce gonflement dans GUVs sous un courant alternatif (AC)¹⁰. Des substrats plus courantes sur lesquelles sont cultivés GUVs sont soit semi conducteurs plaques recouvertes d’oxyde de bidon d’indium (ITO) ou des fils de platine (Pt-fils)¹¹. Dans cet ouvrage, GUVs sont cultivées sur Pt-fils que cette méthode s’est avérée travaillent beaucoup mieux que l’alternative en faisant GUVs en présence de sels dans le tampon¹². Bien que le protocole d’electroformation est décrit ici, avec suffisamment de détails pour le reproduire, nous renvoyons le lecteur aux articles précédents dans lequel similaires et d’autres méthodes de fabrication GUVs ont été décrits en détail^13,14. Dans nos mains, electroformation Pt-fils a avec succès fourni GUVs d’un mélange de lipides synthétiques ou de lipides naturels extraits dans une mémoire tampon contenant ~ 100 mM NaCl. En outre, il était également possible d’encapsuler des protéines à l’intérieur de GUVs durant la croissance. Une chambre d’electroformation exemple est illustrée à la Figure 1 a; Il compose d’environ 10 cm de long deux Pt-fils insérés dans un support de polytétrafluoroéthylène (PTFE) qui peut être scellé des deux côtés avec des lamelles de verre ~ 1-2 cm de distance (Figure 1 a).

Figure 1 : montage expérimental. (A) l’electroformation GUV chambre avec connecteurs électriques fixés sur Pt-fils. Gauche (B) : le système expérimental montrant le microscope, la chambre expérimentale au-dessus de l’objectif et deux micropipettes (gauche et droite) attaché aux micromanipulateurs et insérée dans la chambre expérimentale pour tube en tirant et en protéines injection. A droite : une vue rapprochée de la chambre expérimentale montés au-dessus de l’objectif montrant les pointes de l’aspiration et les micropipettes injection insérées. (C), une seringue équipée d’un distributeur de mince inséré dans une micropipette à son extrémité arrière. Le fond est une vue rapprochée du distributeur à l’intérieur de la micropipette avec la ligne pointillée bleue décrivant la micropipette. Ce système est utilisé pour remplir la micropipette de caséine pour passiver la surface vitrée et aussi vers l’arrière le remplissage avec de l’huile minérale lorsque nécessaire. (D), un système utilisé pour aspirer les quantités µL de la solution de protéines. L’aiguille est reliée à une seringue et au tuyau qui est relié à la micropipette d’injection. La pointe de la micropipette est soigneusement immergée dans la solution de protéine et aspirée donc pour occuper la pointe de la micropipette. Une micropipette est puis retour remplie d’huile minérale en utilisant le système illustré par panneau C. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Un nanotube de membrane, allant de rayon de 7 nm à plusieurs centaines nm, peut être extraite d’un GUV par une force externe. Cette méthode a été initialement conçue pour mesurer les propriétés élastiques des membranes cellulaires et vésicules, par exemple la flexion rigidité^15,16. Dans ses œuvres plus récentes, la méthode a été étendue afin d’étudier l’interaction des protéines avec des membranes incurvés par microinjecting des protéines près le nanotube tiré^7,17. Autres méthodes ont été développées pour l’étude des protéines membranaires-courber. Dans une seule méthode, protéines sont incubés avec les liposomes différemment tailles attachées à une surface passivée. Microscopie confocale est utilisée pour mesurer la liaison aux protéines en fonction du diamètre de liposome, ce qui peut indiquer induite par la courbure tri^18,19. Dans une autre méthode, les protéines sont injectés près d’un micro-aspiré GUV de mesurer leur capacité à induire spontanément des tubules^20,21. La méthode décrite dans le présent protocole est particulièrement bien adaptée pour étudier la membrane-cintrage protéines impliquées dans l’endocytose, où la plupart des protéines rencontrent généralement membrane préformée nanotubes reliant l’invagination de membrane contenant des marchandises avec le membrane de plasma plate sous-jacente. En outre, dans cette méthode, contrairement à dans le dosage avec les liposomes petites piquet, le nanotube de membrane est connecté en permanence à la membrane ; par conséquent, il est en équilibre mécanique avec le GUV, une situation attendue en vivo. Par conséquent, physique de la membrane fondamentale s’applique et nous pouvons en déduire une pléthore des propriétés mécaniques de nos Mensurations^22,23,24.

Pour une implémentation complète de cette méthode, le matériel nécessaire comprend un microscope confocal, pinces optiques et un ou deux micropipettes reliés à un réservoir d’eau (Figure 1 b). En combinant tous les trois, il est possible mesurer la tension de la membrane, courbure de la membrane, masse surfacique de protéines simultanément et tube force²⁵. Micropipette aspiration est essentielle et il est facilement construit en insérant une micropipette de verre dans un support relié à un réservoir d’eau, qui, par l’intermédiaire de la pression hydrostatique, contrôle l’aspiration pression²⁶. Une micropipette et le titulaire sont contrôlés par un micromanipulateur et, idéalement, dans une seule direction par un piezo-déclencheur pour le mouvement de précision. Pour tirer un nanotube, le microaspirated GUV est brièvement coincé à un micron taille perler puis tiré loin créant un nanotube. Dans cette implémentation, le talon est maintenu par des pinces optiques, qui peuvent être construits en suivant un protocole publié²⁷. Il est possible de se passer des pinces optiques et tirez nanotubes de différentes façons, bien qu’au prix de mesure de la force précise. Si c’est trop difficile de construire un piège optique ou si la mesure de la force n’est pas essentielles, telles que si l’on veut simplement vérifier la préférence des protéines des membranes incurvés, un tube peut être tiré à l’aide d’un cordon aspiré à l’extrémité d’un deuxième micropipette²⁸. Il est également possible de tirer des tubes à l’aide de la force de gravitation²⁹ ou^30,31s’écouler. En outre, la microscopie confocale n’est pas indispensable non plus ; Toutefois, il est préférable donc de mesurer la masse surfacique des protéines. Il permet également de mesurer le rayon de nanotube de l’intensité de la fluorescence des lipides dans le tube, donc indépendamment de la force de membrane et tension. INFERER tube rayon de fluorescence est particulièrement important si la relation entre ces grandeurs s’écarte des équations bien établies en raison de la présence de protéines membranaires-adhéré²⁵. Ce qui est important, on ne peut pas distribuer du piège optique et microscopie confocale, car il ne sera pas possible de mesurer la courbure du tube.

La méthode décrite dans le présent protocole a été utilisée pour étudier le tri induite par la courbure de diverses protéines membranaires périphériques sur des nanotubes, surtout ceux de la BAR familial^25,32,33,34 . On a aussi montré que le canal de potassium transmembranaire conique KvAP est enrichi sur courbé nanotubes de la même manière comme barre de protéines,³⁵. En optimisant la méthode pour encapsuler des protéines à l’intérieur de GUVs, l’interaction des protéines, à courbure négative a été récemment étudiée bien³⁶. En outre, cette méthode a été utilisée afin d’élucider la formation de protéines échafaudages^25,37 et pour étudier le mécanisme de scission de la membrane par chaque ligne tension³⁸, protéine dynamine³⁹, ou BAR protéines^40,41. En plus des protéines, petites molécules ou ions peuvent également induire la courbure. En utilisant cette méthode, ions calcium ont montré pour induire une courbure positive sous conditions sans sel⁴². Fait intéressant, il a également été démontré que les lipides peuvent subir courbure tri, mais seulement pour des compositions qui sont près d’un demixing point^43,44. En somme, la méthode peut être utilisée par les chercheurs intéressés à étudier comment chaque composants membranaires intrinsèques (par exemple, lipides ou protéines transmembranaires) ou en périphérie des molécules de liaison (que ce soit à l’intérieur ou à l’extérieur GUVs) interagir avec membranes cylindrique incurvées, du point de vue mécanique et quantitatif. Il est également prévu pour ceux qui souhaitent mesurer les propriétés mécaniques de la membrane elle-même^22,23,45.

Protocol

1. préparation des GUVs par Electroformation sur Pt-fils Nettoyage de la chambre d’electroformation (voir Introduction et Figure 1 a) et les Pt-fils avec un solvant organique comme l’éthanol ou l’acétone pour nettoyer les lipides et l’eau pour laver les sels.NOTE : Nous vous suggérons de bien essuyer loin le résidu avec tissu imbibé d’éthanol puis sonification dans l’acétone, l’éthanol, puis l’eau, pendant 5 min. Préparer un…

Representative Results

L’expérience de tirage de tube peut donner des informations vitales de mécaniques sur la membrane. En l’absence de protéines ou autres molécules qui force de couple avec la courbure de la membrane, la membrane et le rayon du tube peut être liée avec la tension de la membrane en appliquant l’hamiltonien Canham-Helfrich équation dans un tube a tiré un GUV50,51 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

La méthode d’extraction des tubes depuis GUVs donne riche d’informations sur le système de la protéine de la membrane, comme il n’est pas seulement des moyens de mesurer les propriétés mécaniques fondamentales de la membrane, mais il est utile de faire la lumière sur le couplage entre les protéines et les membranes courbure. Tel que mentionné dans l’Introduction, il existe des autres techniques pour mesurer les effets des protéines membranaires-courber, soit en incubant les protéines avec les liposomes…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5