Dra membranet nanorör från Giant Unilamellar blåsor

Summary

Många proteiner i cellen känsla och inducera membran krökning. Vi beskriver en metod för att dra membranet nanorör från lipid blåsor att studera samspelet mellan proteiner eller någon krökning-aktiva molekylen med böjda membran in vitro.

Abstract

En ny utformning av cellmembranet är en integrerad del av många cellulära fenomen, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, etc. Många olika proteiner associera med böjda membran på grund av deras förmåga att känna eller framkalla membran krökning. Vanligtvis, dessa processer omfattar en mängd proteiner att göra dem alltför komplex för att studera kvantitativt i cellen. Här beskriver vi ett protokoll för att rekonstituera en böjd membran i vitro, härma en böjd cellstruktur, såsom endocytic halsen. En jätte unilamellar vesikler (GUV) används som en modell av ett cellmembran, vars inre tryck och ytspänning kontrolleras med mikropipett aspiration. Tillämpa en punkt dragkraft på GUV använder optisk pincett skapar en nanotube av hög krökning ansluten till en platt membran. Denna metod har traditionellt använts för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av lipid membran, såsom bockning styvhet. Under de senaste åren har det utökats för att studera hur proteiner interagerar med membran krökning och hur de påverkar formen och mekanik av membran. Ett system som kombinerar mikromanipulation, Mikroskop, optisk pincett och konfokalmikroskopi tillåter mätning av membran krökning, membran spänning och Ytors av proteiner, samtidigt. Från dessa mätningar, kan många viktiga mekaniska och morfologiska egenskaper av protein-membran systemet utläsas. Dessutom lägger vi ut ett protokoll för att skapa GUVs i närvaro av fysiologiska salt koncentration, och en metod för att kvantifiera Ytors av proteiner på membranet från fluorescens stödnivåer märkta proteiner och lipider.

Introduction

Många cellulära processer, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, infektion, etc., åtföljs av en dramatisk förändring i form av cellmembran^1,2. I cellen delta ett antal proteiner i dessa processer genom att binda till membranet och att ändra sin form. De mest kända exemplen är medlemmar av proteinfamiljen Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), som innehåller en egenskap som egensäkra böjd BAR domän^3,4,5,6,7. Vanligtvis interagerar de med membranet genom att följa BAR domänen till ytan och, i många fall också grunt infoga amfipatiska spiraler i lipidens. Form, storlek och kostnad av domänen BAR tillsammans med antalet amfipatiska spiraler avgör: (1) riktningen av membran krökning (dvs.om de kommer att framkalla invaginations eller utskjutande delar), och (2) omfattningen av membran krökning^5,8. Notera definieras här positiva krökning som den konvexa sidan av böjda membranet, dvs, bucklan mot samverkande partikeln, och negativa annars. Kvantitativa studier av BAR proteiner visade dessutom att deras effekt på membranet är beroende av en uppsättning fysiska parametrar: surface täthet av proteiner, membran spänning och membran form (platta kontra tubulär kontra sfäriska form)⁷. Beroende på dessa parametrar BAR proteiner kan: (1) fungerar som sensorer av membran krökning, (2) böja membran eller (3) inducera membran scission⁷.

På grund av det stora antalet komponenter inblandade i membran omforma i cellen, studera de kvantitativa aspekterna av fenomen, såsom endocytos, är i vivo extremt utmanande. In vitro beredning av minimal komponenter härma böjda membran i cellen ger möjlighet att få en mekanistisk förståelse av hur membran-svängda proteiner fungerar. I artikeln beskrivs ett protokoll för att rekonstituera en membran nanotube i vitro med mikromanipulation, konfokalmikroskopi, och optisk pincett. Metoden kan användas för att studera, på ett kvantitativt sätt, hur proteiner, lipider eller små molekyler interagerar med böjda membran. Lipid GUVs används som modeller för ett cellmembran, vars krökning är försumbar jämfört med storleken på samverkande membran-svängda molekyler. De är beredda med electroformation metod⁹ där blåsor bildas av återfuktande en lipid film och svullnad det in GUVs under en växelström (AC)¹⁰. Vanligaste substrat som GUVs odlas är antingen halvledande plattor belagda med indium tinoxiden (ITO) eller platinum ledningar (Pt-trådarna)¹¹. I detta arbete odlas GUVs på Pt-trådar som denna metod har visat sig fungera mycket bättre än alternativet att göra GUVs i närvaro av salter i buffert¹². Även om protokollet electroformation beskrivs här utförligt återge det, hänvisar vi läsaren till tidigare artiklar där liknande och andra metoder för att göra GUVs har beskrivits i detalj^13,14. I våra händer, har electroformation på Pt-trådar framgångsrikt gett GUVs från en blandning av syntetiska lipider eller naturliga lipid extrakt i en buffert som innehåller ~ 100 mM NaCl. Dessutom var det också möjligt att kapsla in proteiner inuti GUVs under tillväxt. En exempel electroformation kammare visas i figur 1A; Den består av två ~ 10-cm-lång Pt-trådarna infogats i en hållare tillverkad av polytetrafluoreten (PTFE) som kan förseglas på båda sidor med glas coverslips ~ 1-2 cm mellanrum (figur 1A).

Figur 1: Experimental setup. (A) den GUV electroformation kammare med elektriska kontakter knutna till Pt-trådar. (B) vänster: experimentell systemet visar mikroskopet, experimentell kammare ovanför målet och två Mikropipetter (vänster och höger) bifogas micromanipulators och infogas i den experimentella avdelningen för röret att dra och protein injektion. Höger: en närbild på experimentella avdelningen monterade ovanför målet visar tips av strävan och de injektion Mikropipetter införas. (C), en spruta försedd med en tunn dispenser som infogas i en mikropipett på dess bakre änden. Botten är en närbild av dispensern inuti mikropipett med den blå streckade linjen beskriver mikropipett. Detta system används för att fylla mikropipett med kasein passiverande glasytan och även tillbaka fyllning med mineralolja när det behövs. (D) ett system används för att aspirera µL mängder protein lösningen. Nålen är ansluten till en spruta och slang som är ansluten till den injektion mikropipett. Mikropipett spetsen är noggrant nedsänkt i protein lösningen och aspirerade så för att fylla mikropipett spetsen. Mikropipett fylls sedan tillbaka med mineralolja använder systemet visas i panelen C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

En membran nanotube, varierar i radie från 7 nm till flera hundra nm, kan dras från en chef av en extern kraft. Denna metod var ursprungligen avsedd att mäta de elastiska egenskaperna hos cellmembran och blåsor, såsom den böjande styvhet^15,16. I den senaste verk förlängdes metoden för att studera samspelet mellan proteiner med böjda membran av microinjecting proteiner nära den drog nanotube^7,17. Andra metoder har utvecklats för att studera membran-svängda proteiner. I en metod inkuberas proteiner med olika stora liposomer bundna till en passiverad yta. Konfokalmikroskopi används för att mäta bindningen som en funktion av Liposom diameter, vilket kan indikera krökning-inducerad sortering^18,19. I en annan metod injiceras proteiner nära en mikro-aspirerade GUV att mäta sin förmåga att spontant framkalla tubuli^20,21. Den metod som beskrivs i detta protokoll är unikt lämpade att studera membran-svängda proteinerna som är inblandade i endocytos, där de flesta proteiner normalt möter förformade membran nanorör ansluta den last-innehållande membran invagination med den underliggande platt plasma membran. Dessutom i denna metod ansluten till skillnad från i analysen med uppbundna små liposomer, den membran nanotube kontinuerligt till membranet; Därför är det i mekaniska jämvikt med GUV, en situation som förväntat i vivo. Därför grundläggande membran fysik gäller och vi kan härleda en uppsjö av mekaniska egenskaper från våra mätningar^22,23,24.

För en fullständig implementering av denna metod inkluderar nödvändig utrustning confocal Mikroskop, optisk pincett och en eller två Mikropipetter ansluten till en vattentank (figur 1B). Genom att kombinera alla tre, är det möjligt att samtidigt mäta spänning membran, membran krökning, Ytors av proteiner och tube kraft²⁵. Mikropipett aspiration är viktigt och den är enkelt uppbyggd genom att infoga en glas mikropipett i en hållare som är ansluten till en vattentank, som, via hydrostatiskt tryck, kontrollerar den aspiration tryck²⁶. Mikropipett och innehavaren styrs av en micromanipulator och helst i en riktning av en piezo-ställdon för precision rörelse. Att dra en nanotube, den microaspirated GUV kort fastnar till en micron stora pärla sedan drog bort skapar en nanotube. I detta genomförande hålls kornet av optisk pincett, som kan konstrueras genom att följa en publicerade protokoll²⁷. Det är möjligt att avstå från optisk pincett och pull nanorör på olika sätt, men på bekostnad av korrekt kraft mätningar. Om det är alltför utmanande att bygga en optisk fälla eller om kraft mätningar är inte nödvändiga, såsom om man bara vill kontrollera inställningen av proteiner för böjda membran, en tub kan dras med en pärla som aspirerade på spetsen av en andra mikropipett²⁸. Det är också möjligt att dra rören med hjälp av gravitationskraften²⁹ eller flöde^30,31. Konfokalmikroskopi är dessutom inte nödvändigt heller; dock är det att föredra så att mäta Ytors av proteiner. Det gör också mäta nanotube radien från fluorescensintensiteten hos lipider i röret, således oberoende av membran kraft och spänning. Inferring tube radie från fluorescens är särskilt viktigt om förhållandet mellan dessa kvantiteter avviker från väletablerade ekvationer på grund av förekomsten av membran-följs proteiner²⁵. Ännu viktigare, en kan inte avstå från både optisk fälla och konfokalmikroskopi, eftersom det inte är möjligt att mäta tube krökning.

Metoden som beskrivs i detta protokoll har använts för att studera krökning-inducerad sortering av olika perifera membranproteiner på nanorör, främst de från BAR familj^25,32,33,34 . Det visade också att den koniskt formade transmembrana kaliumkanal som KvAP är berikad på böjda nanorör på samma sätt som BAR proteiner³⁵. Genom att optimera metoden för att kapsla in proteiner inuti GUVs, har samspelet mellan proteiner med negativ krökning nyligen undersökts som väl³⁶. Dessutom, denna metod har använts att belysa bildandet av protein ställningar^25,37 och att studera mekanismen av membran scissionen av antingen linje spänning³⁸, protein dynamin³⁹, eller BAR proteiner^40,41. Förutom proteiner, kan små molekyler eller joner också inducera krökning. Med den här metoden visades kalciumjoner att framkalla positiva krökning enligt saltfri villkor⁴². Intressant, har det också visat att lipider kan genomgå krökning sortering, men endast för kompositioner som är nära en demixing punkt^43,44. Sammanfattningsvis metoden kan användas av forskare som är intresserade av att undersöka hur antingen integrerad membran komponenter (t.ex., lipider eller transmembrana proteiner) eller perifert bindande molekyler (antingen inuti eller utanför GUVs) samverkar med cylindriskt böjda membran, mekaniska och kvantitativ synvinkel. Det är också avsett för dem som är intresserade av att mäta de mekaniska egenskaperna av membranet sig^22,23,45.

Protocol

1. beredning av GUVs av Electroformation på Pt-trådar Rengör electroformation kammaren (se Inledning och figur 1A) och Pt-kablarna med ett organiskt lösningsmedel som etanol eller aceton till att tvätta bort lipider och vatten att tvätta bort salter.Obs: Vi föreslår noggrant torka bort återstoden med etanol-indränkt vävnad och sonicating i aceton, etanol, vatten, var och en för 5 min sedan. Förbereda en lipid blandning av en önskad lipid…

Representative Results

Tube-pulling experimentet kan ge viktig mekanisk information om membranet. I avsaknad av proteiner eller andra molekyler som par med membran krökning, membranet kraft och tube radie kan relateras med membran spänning genom att tillämpa den Canham-Helfrich Hamiltonsk drog ekvationen till ett rör från en GUV50,51 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/560…

Discussion

Metoden för att dra rör från GUVs ger rik information om membranprotein systemet, det är inte bara medel för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av membranet, men den hjälper till att belysa kopplingen mellan proteiner och membran krökning. Som diskuterats i inledningen, finns andra tekniker för att mäta effekterna av membran-svängda proteiner, antingen genom ruvning proteinerna med sub micron liposomer bundna till en passiverad yta^18,19 …

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5