Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas
Summary
Descreveremos um protocolo para visualização de exocitose de insulina em ilhotas intactas usando pHluorin, uma proteína verde fluorescente de sensíveis ao pH. Ilhotas isoladas estão infectadas com vírus adenoide codificação pHluorin juntamente com a carga de vesículas neuropeptide Y. Isto permite a detecção de eventos de fusão de grânulo de insulina por microscopia confocal.
Abstract
A secreção de insulina desempenha um papel central na homeostase de glicose sob condições fisiológicas normais, bem como na doença. Abordagens atuais para estudar a exocitose de grânulos de insulina que ou usar eletrofisiologia ou microscopia acoplado à expressão de repórteres fluorescentes. No entanto, a maioria destas técnicas foram otimizada para linha celular clonal ou exige dissociando ilhotas pancreáticas. Em contraste, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real de exocitose de grânulos de insulina em ilhotas pancreáticas intactas. Neste protocolo, descrevemos primeiro a infecção viral de ilhotas pancreáticas isoladas com adenovírus que codifica uma pH sensíveis à proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada ao neuropeptídeo Y (NPY). Em segundo lugar, descrevemos o confocal imagens de Ilhéus cinco dias após a infecção viral e como monitorar a secreção de insulina do grânulo. Brevemente, os ilhéus infectados são colocados em uma lamela em uma câmara de imagens e fotografados sob um microscópio confocal laser de varredura vertical enquanto continuamente sendo perfundidos com solução extracelular que contém vários estímulos. Imagens confocal abrangendo 50 µm de ilhota são adquiridas como gravações de lapso de tempo usando um scanner rápido-ressonante. A fusão dos grânulos de insulina com a membrana plasmática pode ser seguida ao longo do tempo. Este procedimento também permite testar uma bateria de estímulos em uma única experiência, é compatível com mouse e ilhotas humanas e pode ser combinado com vários corantes para a imagem latente funcional (e.g., corantes de cálcio citosólico ou potencial de membrana).
Introduction
Insulina é produzida pelas células beta das ilhotas pancreáticas e é um regulador chave da glicose metabolismo1. Morte ou disfunção das células beta perturba a homeostase de glicose e leva a diabetes2. Insulina é embalada em grânulos densos núcleos que são liberados em uma Ca2 +-dependente forma3. Elucidar como exocitose de grânulos de insulina é regulada é essencial para compreender plenamente o que determina a secreção de insulina e abre novos caminhos para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes.
Exocitose de insulina tem sido estudado extensivamente usando abordagens eletrofisiológicas, tais como medidas de capacitância de membrana e abordagens microscópicas em combinação com moléculas fluorescentes. Medidas de capacitância de membrana têm boa resolução temporal e permitam gravações de célula única. No entanto, alterações na capacitância refletem a variação líquida de superfície da célula e não capturar eventos de fusão individuais ou distinguir a fusão de grânulo de insulina de outras vesículas secretoras não insulino-3. Abordagens microscópicas, tais como a microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total ou dois fotões em combinação com sondas fluorescentes e proteínas de carga de vesículas, fornecem detalhes adicionais. Estas técnicas capturar eventos os únicos e também as fases pré e pós-os e podem ser usadas para estudar os padrões em populações de células3.
Os repórteres fluorescentes podem ser de três tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática ou 3) vesicular. 1) extracelulares repórteres são marcadores polares (por exemplo, dextranos, sulforhodamina B (SRB), Lúcifer amarelo, pyranine) que podem ser introduzidos através do meio extracelular4. O uso de traçadores polares permite para a investigação dos poros em uma população de células de fusão e captura várias estruturas intercelulares, tais como os vasos sanguíneos. No entanto, eles não informam sobre o comportamento de carga de vesículas. 2) citoplasmáticos repórteres são sondas fluorescentes acopladas a proteínas de membrana-associado que enfrentam o citoplasma e são envolvidos no encaixe e exocitose. Exemplos incluem membros da solúvel N– proteà sensível fator acessório proteína receptor (SNARE) família que têm sido utilizados com sucesso em neurociência para o estudo de liberação de neurotransmissor5. Essas proteínas têm múltiplos parceiros de ligação e não são insulino-grânulo específico. 3) vesiculares repórteres são sondas fluorescentes fundidas às proteínas vesiculares de carga que permitem a investigação do comportamento de carga específicos vesículas. Proteínas de carga específica de insulina-grânulo incluem insulina, peptídeo-c, polipeptídeo amiloide ilhéu e NPY entre outros6,7. NPY somente está presente em insulina contendo grânulos e co é lançado com insulina, tornando-se um excelente parceiro para um repórter fluorescente8.
A fusão de diferentes proteínas fluorescentes para NPY foi anteriormente empregada para estudar vários aspectos da exocitose em células neuroendócrinas, tais como a exigência de synaptotagmin específico isoformas9,10 e como o tempo-curso de libertação depende o citoesqueleto de actina e miosina II11,12. Neste estudo, optamos por pHluorin como o repórter fluorescente, que é um GFP modificado que é não-fluorescente em pH ácido dentro do núcleo denso grânulo mas torna-se brilhantemente fluorescente após a exposição para o neutro pH extracelular13. Grânulos de insulina madura tem um pH ácido abaixo de 5,5. Uma vez que o grânulo funde-se com a membrana plasmática e abre, sua carga é exposta ao neutro pH extracelular de 7.4, permitindo o uso da pHluorin de proteínas sensíveis ao pH como repórter7,14.
Tendo em conta a natureza sensível do pH de pHluorin e a expressão seletiva de NPY nos grânulos de insulina, a construção de fusão NPY-pHluorin pode ser usada para estudar várias propriedades de exocitose de grânulos de insulina. A entrega viral da construção de fusão garante transfeccao de alta eficiência e trabalha na primária as células beta ou linhas de células, bem como sobre ilhotas isoladas. Esse método também pode ser usado como uma diretriz para o estudo de exocitose em qualquer outro tipo de célula com vesículas contendo NPY. Ele também pode ser combinado com qualquer modelo de rato geneticamente modificado para estudar os efeitos de certas condições (knockdowns, superexpressão, etc) na exocitose. Esta técnica tem sido usada anteriormente para caracterizar os padrões espaciais e temporais da secreção de insulina grânulo em populações de células beta nas ilhotas humana15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para visualizar a exocitose de grânulos de insulina em células beta dentro de ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Ele usa NPY-pHluorin como o repórter fluorescente clonado em adenovírus para garantir uma eficiência elevada do transfection.
Embora o método fosse altamente eficiente em nossas mãos, ele pode requerer algumas modificações que dependem principalmente de dois parâmetros: 1) a qualidade da prepara…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a Marcia Boulina partir da DRI facilidade do núcleo para ajuda com os microscópios de imagem. Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 e DK084321 R56 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
Referências
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
