Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Summary

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Abstract

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por flujo de aire persistente limitación y pulmón parenquimatosa la destrucción. Tiene una incidencia muy elevada en las poblaciones que envejecen. Las actuales terapias convencionales para EPOC foco principalmente en síntomas medicamentos; por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas terapias. Modelos animales calificados de EPOC podrían contribuir a caracterizar los mecanismos subyacentes y pueden ser utilizados para detección de drogas nuevas. Modelos actuales de la EPOC, como el lipopolisacárido (LPS) o la elastasa pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema inducido, generar EPOC-como lesiones en los pulmones y vías respiratorias pero no de lo contrario se asemejan a la patogenia de la EPOC humana. Un humo de cigarrillo (CS)-modelo inducido sigue siendo uno de los más populares ya que no sólo simula EPOC-como lesiones en el sistema respiratorio, pero también se basa en uno de los principales materiales peligrosos que causa EPOC en los seres humanos. Sin embargo, los aspectos desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva del modelo CS-inducida dramáticamente limitan su aplicación en la detección de drogas de nuevo. En este estudio, hemos generado con éxito un nuevo modelo de EPOC mediante la exposición de ratones con altos niveles de ozono. Este modelo demostró lo siguiente: 1) disminuido volumen expiratorio forzado 25, 50 y 75/forzado capacidad vital (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC y VEF₇₅/FVC), indicando el deterioro de la función pulmonar; 2) alvéolos del pulmón ampliada, con destrucción parenquimatosa pulmonar; 3) reduce el tiempo de fatiga y la distancia; y 4) aumenta la inflamación. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el modelo de exposición (OE) de ozono es un modelo confiable que es similar a los seres humanos debido a la sobreexposición de ozono es uno de los factores etiológicos de la EPOC. Además, sólo tomó 6-8 semanas, basados en nuestro trabajo anterior, para crear un modelo de OE, mientras que se requiere de 3 a 12 meses para inducir el modelo de humo de cigarrillo, lo que indica que el modelo de OE puede ser una buena opción para la investigación de la EPOC.

Introduction

Se ha estimado que la EPOC, incluyendo bronquitis crónica y enfisema podría ser la tercera causa de muerte en el mundo en el 2020^1,2. Se estima la potencial incidencia de EPOC en una población de más de 40 años 12.7% en los hombres y 8,3% en las mujeres dentro de los próximos 40 años³. No hay medicamentos están disponibles para revertir el deterioro progresivo en la EPOC pacientes⁴. Modelos animales confiables de la EPOC no sólo demandan la imitación del proceso patológico de la enfermedad pero también requieren un período de generación corto. Modelos actuales de la EPOC, incluyendo los LPS o un modelo de EPI-inducida, pueden inducir síntomas de enfisema^5,6. Una sola administración o un reto de la semana de LPS o PPE resultados ratones o ratas en marcada neutrofilia en el lavado broncoalveolar (BALF), aumentos de mediadores proinflamatorios (p. ej., TNF-α y IL-1β) en suero, o BALF produce pulmón espacios de aire agrandado de destrucción parenquimatosas y límites aire^5,6,7,8,9,10. Sin embargo, LPS o EPI no son causas de EPOC humana y así no imitan el proceso patológico¹¹. Un modelo CS-inducida produce una limitación del flujo de aire persistente, destrucción de parénquima pulmonar y redujo la capacidad de ejercicio funcional. Sin embargo, un protocolo tradicional de CS requiere al menos 3 meses para generar un EPOC modelo^12,13,14,15. Por lo tanto, es importante generar un nuevo modelo de animal más eficiente que cumpla los dos requisitos.

Recientemente, además del consumo de cigarrillo, contaminación del aire y la exposición ocupacional se han convertido en causas más comunes de EPOC^16,17,18. El ozono, como uno de los principales contaminantes (aunque no es el componente principal de la contaminación atmosférica), directamente puede reaccionar con el tracto respiratorio y dañar el tejido pulmonar de los niños y jóvenes adultos^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozono, así como otros estimulantes, incluyendo LPS, PPE y CS, participan en un serio de vías bioquímicas de estrés oxidativo pulmonar y daños en el ADN y están vinculadas a la iniciación y la promoción de EPOC^26,27. Otro factor es que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de estar expuesto al ozono, lo que indica que el ozono puede interrumpir pulmón función^18,28,29. Por lo tanto, nos genera un nuevo modelo de EPOC al exponer repetidamente ratones a altas concentraciones de ozono durante 7 semanas; Esto dio lugar a defectos de flujo de aire y daños parenquimatosos pulmonares similares a los de anteriores investigaciones^30,31,32. Extendió el protocolo de OE a ratones hembra en este estudio y reproducir con éxito el enfisema en ratones machos en nuestros anteriores estudios^30,31,32. Porque ha disminuido la mortalidad de la EPOC en los hombres aumentó en las mujeres en muchos países³³, un modelo de EPOC en las mujeres es necesario para estudiar los mecanismos y desarrollar métodos terapéuticos para pacientes EPOC. La aplicabilidad del modelo OE para todos los géneros presta ayuda adicional a su uso como un modelo de EPOC.

Protocol

Nota: OE el modelo ha sido generado y utilizado en la investigación previamente divulgados 30 , 31 , 32. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Jiaotong de Shanghai. 1. ratones centro casa libre de patógeno, de 7 a 9 semanas de edad hembra ratones BALB/c en jaulas individuales ventiladas en …

Representative Results

Ejemplos de imágenes 3D µCT de cada grupo se muestran en la figura 1un. Los ratones expuestos al ozono tenían un volumen pulmonar total significativamente mayor (figura 1a y b) y LAA % (figura 1c) de los ratones de control expuestos al aire. La capacidad pulmonar y LAA % seguían elevadas después de seis semanas de la exposición de ozono<sup cla…

Discussion

En este estudio, presentamos un método confiable para la generación de un nuevo modelo de EPOC. En comparación con otros modelos (es decir, LPS o modelos de EPI), este modelo de OE recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC. Porque el humo del cigarrillo es el principal material peligroso que causa EPOC en pacientes humanos con⁴⁰, el modelo CS sigue siendo el más popular EPOC modelo^41,42. Sin embargo, el modelo CS…

Materials

BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.