反复臭氧暴露对小鼠慢性阻塞性肺疾病模型的产生

Summary

这项研究描述了一个新的慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 动物模型的成功生成, 反复暴露小鼠到高浓度的臭氧。

Abstract

慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 的特点是持续气流限制和肺实质破坏。它在老龄人口中的发病率很高。目前常规的 COPD 治疗主要集中在症状修饰药物;因此, 迫切需要开发新的治疗方法。合格的慢性阻塞性肺病动物模型有助于确定基本的机制, 并可用于新的药物筛选。目前的 copd 模型, 如脂多糖 (LPS) 或猪胰弹性蛋白酶 (PPE) 诱导肺气肿模型, 产生 copd 样病变的肺部和呼吸道, 但没有其他类似的发病机制的人 copd。香烟烟雾 (CS) 诱导模型仍然是最流行的之一, 因为它不仅模拟 copd 样病变的呼吸系统, 但它也基于其中一个主要的危险物质, 导致 copd 的人。然而, CS 诱导模型的耗时和 labor-intensive 的方面极大地限制了它在新药筛选中的应用。在这项研究中, 我们成功地产生了一个新的 COPD 模型, 暴露小鼠到高水平的臭氧。该模型显示如下: 1) 减少了强迫呼气体积 25, 50, 75/强迫肺活量 (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC, 和 FEV₇₅/FVC), 表明肺功能恶化;2) 肺肺泡肿大, 肺实质破坏;3) 减少疲劳时间和距离;和 4) 炎症增加。综合起来, 这些数据表明, 臭氧暴露模型是一种与人类相似的可靠动物模型, 因为臭氧过度曝光是 COPD 的病因之一。此外, 根据我们以前的工作, 它只花了 6-8 周, 创建一个 OE 模型, 而它需要 3-12 月, 以诱导卷烟烟雾模型, 表明 oe 模型可能是一个很好的选择 COPD 的研究。

Introduction

据估计, COPD, 包括肺气肿和慢性支气管炎, 可能是世界上的第三个主要死因在 2020年^1,2。在未来40年³中, 在40岁以上的人口中, COPD 的潜在发病率估计为12.7% 男性, 8.3% 为女性。目前尚无药物可逆转 COPD 患者的渐进性恶化⁴。可靠的 COPD 动物模型不仅要求对疾病的病理过程进行模拟, 而且需要较短的周期。目前的 COPD 模型, 包括 LPS 或 PPE 诱发的模型, 可以诱发肺气肿样症状^5,6。一个单一的管理或一个星期的挑战, LPS 或 PPE 的小鼠或大鼠结果在支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的显着中性, 增加炎调解人 (例如, TNF-α和 IL-1β) 在 BALF 或血清, 产生肺实质破坏-扩大空气空间, 并限制气流^5,6,7,8,9,10。然而, LPS 或 PPE 不是人类慢性阻塞性肺病的原因, 因此不模仿病理过程¹¹。CS 诱导模型产生持续气流限制, 肺实质破坏, 并减少功能锻炼能力。但是, 传统的 CS 协议至少需要3月才能生成 COPD 模型^12,13,14,15。因此, 重要的是要产生一个新的, 更有效的动物模型, 满足这两个要求。

最近, 除了吸烟, 空气污染和职业暴露已成为更常见的原因 COPD^16,17,18。臭氧作为主要污染物之一 (虽然不是空气污染的主要成分), 可以直接与呼吸道发生反应, 损害儿童和青年成人的肺组织^{19,20,21 ,22,23,24,25}。臭氧, 以及其他刺激, 包括 LPS, PPE, 和 CS, 参与了严重的生化途径的肺氧化应激和 DNA 损伤, 并与启动和促进 COPD^26,27。另一个因素是, 一些 COPD 患者的症状在暴露于臭氧后恶化, 表明臭氧会扰乱肺部功能^18,28,29。因此, 我们产生了一个新的 COPD 模型, 反复暴露小鼠到高浓度的臭氧7周;这导致气流缺陷和肺部实质损伤类似于以前的调查^30,31,32。我们在本研究中推广了对雌性小鼠的 OE 协议, 并成功地再现了我们以前研究的雄性小鼠的肺气肿^30,31,32。由于 copd 死亡率在男性减少, 但在许多国家的妇女增加了³³, 需要对女性 copd 模型进行研究, 以探讨慢性阻塞性肺病患者的发病机制和治疗方法。OE 模型对所有性别的适用性进一步支持它作为 COPD 模型的使用。

Protocol

注意: OE 模型已经生成并用于以前报告的研究 30 、 31 、 32 。所有动物实验均经上海交通大学机构动物护理与使用委员会 (IACUC) 批准. 1. 鼠标 在受控温度 (20 和 #176; c) 和湿度 (40-60%) 的动物设施的单个通风笼中, 无病原体、7至9周老的雌性 balb/c/c 小鼠。提供12和 #160; h 光和 12 #160; 设备中的暗循…

Representative Results

每个组的3D µCT 图像的示例显示在图 1a中。臭氧暴露的小鼠的总肺容积明显较大 (图 1a 和 b) 和 LAA% (图 1c) 比 air-exposed 控制小鼠。六周的臭氧暴露后, 肺容积和 LAA% 保持升高31,32。肺容积和 LAA% 的增加代表肺气肿的表型。肺肺…

Discussion

在这项研究中, 我们提出了一个可靠的方法来生成一个新的 COPD 模型。与其他模型 (即LPS 或 PPE 模型) 相比, 此 OE 模型重述 COPD 患者的病理过程。由于香烟烟雾是导致人患 copd 的主要危险物质⁴⁰, CS 模型仍然是最受欢迎的 copd 模型^41,42。然而, CS 模型需要 3-到12月的 r-和 #38;D 期新药。与 CS 模型相比, 目前的 OE 模型将生成周期缩短为6-…

Materials

BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.