In Vivo Identifiering och analys av Rb proteinet SUMOylation i mänskliga celler
Summary
Liten ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO) familj proteiner konjugeras till lysin resthalter av målproteiner att reglera olika cellulära processer. Detta dokument beskriver ett protokoll för detektion av retinoblastom (Rb) protein SUMOylation under endogena och exogena förhållanden i mänskliga celler.
Abstract
De post-translationella modifieringar av proteiner är avgörande för korrekt reglering av intracellulära signaltransduktion. Bland dessa ändringar är små ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO) en ubiquitin-liknande protein som är kovalent kopplad till lysin resthalter av en mängd målproteiner att reglera cellulära processer, såsom transkription av gener, DNA-reparation, protein interaktion och nedbrytning, subcellulär transport och signaltransduktion. Den vanligaste metoden att upptäcka protein SUMOylation baseras på uttryck och rening av rekombinanta märkta proteiner i bakterier, vilket möjliggör en in vitro- biokemisk reaktion som är enkla och lämpar sig för adressering mekanistiska frågor. Det är dock på grund av komplexiteten i processen för SUMOylation i vivo, svårare att upptäcka och analysera protein SUMOylation i celler, särskilt när villkor endogena. En färsk studie av författarna till detta dokument visade att endogena retinoblastom (Rb) protein, en tumörsuppressor som är avgörande för negativ reglering av Cellcykelprogression, specifikt SUMOylated på den tidiga G1-fasen. Detta dokument beskriver ett protokoll för detektering och analys av Rb SUMOylation under både endogena och exogena förhållanden i mänskliga celler. Detta protokoll är lämpliga för fenotypiska och funktionell undersökning av SUMO-ändring av Rb, liksom många andra SUMO-riktade proteiner, i mänskliga celler.
Introduction
Noggrann kontroll av cellcykelns förlopp i eukaryota celler är baserad på ett tight regulatoriska nätverk, vilket säkerställer att särskilda händelser äga rum i en ordnad sätt1,2. En av de viktigaste aktörerna i detta nätverk är proteinet retinoblastom (Rb), det första klonade tumör suppressor1,3. Rb proteinet tros vara en negativ regulator av cellcykelns förlopp, särskilt för G0/G1 S fasövergång, och tumör tillväxt4,5. Misslyckande av Rb funktion leder antingen direkt till de vanligaste intraokulära malignitet hos barn, retinoblastom, eller bidrar till utvecklingen av många andra typer av cancer5. Rb är dessutom involverad i många cellulära vägar, inklusive celldifferentiering, kromatin remodeling och mitokondrier-medierad apoptos3,6,7.
Post-translationella modifieringar spelar en central roll i regleringen av RB funktion8,9. Fosforylering är en sådan ändring, och det leder vanligtvis till Rb inaktivering. I quiescent G0 celler är Rb aktiv med en låg fosforylering nivå. Som cellerna framsteg genom G0/G1-fasen, är Rb sekventiellt hyper-fosforyleras av en serie av cyklin-beroende proteinkinaser (CDKs) och cyclins, till exempel cyklin E/CDK2 och cyklin D/CDK4/6, som inaktivera Rb och eliminera dess förmåga att undertrycka cellcykeln relaterade gen uttryck4,10. RB kan också ändras genom små ubiquitin-relaterade modifierare (SUMO)11,12,13.
SUMO är en ubiquitin-liknande protein som är kovalent kopplad till en mängd målproteiner. Det är avgörande för olika cellulära processer, inbegripet cellcykelns reglering, transkription, protein cellulär lokalisering och nedbrytning, transport och DNA reparation14,15,16, 17 , 18. the SUMO konjugation pathway består av dimeriskt SUMO E1 aktiverande enzymet SAE1/UBA2, enda E2 konjugera enzymet Ubc9, flera E3 ligases och SUMO-specifika proteaser. Allmänhet, begynnande SUMO proteiner måste bearbetas proteolytically för att generera mogen form. Den mogna SUMO aktiveras av den E1 heterodimer och överförs sedan till E2 enzymet Ubc9. Slutligen, den C-terminal glycin av SUMO är kovalent konjugerad med den mål lysin av substrat, och denna process underlättas vanligtvis av E3 ligases. SUMO proteinet kan tas bort från den modifierade substraten av specifika proteaser. En tidigare studie av författarna till detta dokument visade att SUMOylation av Rb ökar dess bindning till CDK2, leder till hyper-fosforylering på den tidiga G1-fasen, en process som är nödvändig för cellcykeln progression13. Vi har också visat att förlusten av Rb SUMOylation orsakar en minskad cellproliferation. Det var dessutom nyligen visat att SUMOylation av Rb skyddar Rb proteinet från proteasomen omsättning, vilket ökar nivån av Rb protein i cellerna19. Därför spelar SUMOylation en viktig roll i Rb-funktionen i olika cellulära processer. Fortsätta att undersöka de funktionella konsekvens och fysiologiska relevansen av Rb SUMOylation, det är viktigt att utveckla en effektiv metod för att analysera SUMO status för Rb i mänskliga celler eller vävnader som patienten.
SUMOylation är en reversibel, högdynamiska process. Det är således vanligtvis svårt att upptäcka de SUMO-modifierade proteinerna helt endogena villkor. Detta dokument presenterar en metod för att upptäcka endogena Rb SUMOylation. Dessutom visar den hur man upptäcker exogena Rb SUMOylation av både vildtyps-Rb och dess SUMO-brist mutation11. I synnerhet beskrivs Jacobs et al. en metod för att öka SUMO modifiering av ett visst substrat specifikt av Ubc9 fusion-riktade SUMOylation (UFDS)20. Baserat på denna metod, beskriver det här protokollet hur du analyserar Tvingad SUMOylation av Rb och dess funktionella konsekvenser. Med tanke på att hundratals SUMO substrat har beskrivits tidigare och mer förmodad SUMO substrat har identifierats från många proteomiska-baserade analyser, kan detta protokoll användas för att analysera SUMO-modifiering av dessa proteiner i mänskliga celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver ett protokoll för att identifiera och analysera den endogena SUMOylation av Rb i mänskliga celler. Eftersom denna metod är särskilt inriktad på endogena Rb proteinet utan någon alternationen av globala SUMO-relaterade signal, är det ett viktigt verktyg för att undersöka Rb-SUMO ändring under helt naturliga fysiologiska förhållanden.
För att uppnå detta mål är det viktigt att komma ihåg att: 1) även om SUMO består av fyra isoformer (SUMO1-4, varje kod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från vetenskap och teknik kommissionen av Shanghai (Grant nr 14411961800) och National Natural Science Foundation Kina (Grant nr 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
Referências
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
