生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析
Summary
小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) ファミリー蛋白質は様々 な細胞プロセスを調整するターゲット蛋白質のリジン残基に抱合します。本稿では、rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の内因性と外因性の条件下での検出のためのプロトコルについて説明します。
Abstract
タンパク質の翻訳後修飾は、細胞内シグナル伝達の適切な規則のために重要です。これらの変更の間で小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) は様々 な遺伝子の転写、DNA 修復、タンパク質などの細胞プロセスを調整するターゲットたんぱく質のリジン残基に共有結合で結合されているユビキチン様タンパク質相互作用と低下、細胞内輸送、およびシグナル伝達。タンパク質 sumo 化を検出する最も一般的な方法は、体外で生化学的反応は、シンプルで機械的に対処するために適しているを可能にする、細菌の遺伝子組換えの付けられた蛋白質の浄化、表現に基づいてください。質問。しかし、生体内でsumo 化のプロセスの複雑さのためそれは検出細胞、特に内因性条件下で sumo 化阻害を分析してより困難です。この論文の著者らによる最近の研究では、内因性網膜芽細胞腫 (Rb) 蛋白質、細胞周期の進行の負の調節に不可欠である腫瘍のサプレッサーでは、G1 初期の特に SUMOylated を明らかにしました。本稿では、検出とひと細胞の内因性と外因性の条件下で Rb sumo 化の分析のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは多く他相撲ターゲット蛋白質、ヒトの細胞と同様に、Rb、SUMO 化の表現型および機能調査に適しています。
Introduction
真核細胞の細胞周期の進行の正確な制御は、順序付けられた方法1,2で特定のイベントが起こることにより、タイトな規制のネットワークに基づいています。このネットワークの主要なプレーヤーの 1 つは、最初のクローンとして作られた腫瘍サプレッサー1,3(Rb) 網膜芽細胞腫タンパク質です。Rb タンパク質は、細胞周期の進行、特に S 相転移と腫瘍成長4,5に G0/G1 のための負の調節因子と考えられています。Rb 機能のエラーどちらかに直結する子供たちは、最も一般的な眼内悪性腫瘍、網膜芽細胞腫または癌5の他の多くのタイプの開発に貢献。また、Rb は、細胞の分化、クロマチン再構築、およびミトコンドリアを介したアポトーシス3,6,7を含む多くの携帯電話経路に関与しています。
ポスト翻訳の修正は、RB 関数8,9の調節に重要な役割を果たします。リン酸化はこのような 1 つの変更、それは通常 Rb 不活化につながります。Rb は、静止の G0 細胞低リン酸化レベルでアクティブ。G0/G1 期で細胞、Rb は順番にハイパー-リン酸化 Rb を不活性化し、細胞周期を抑制する能力を排除するサイクリン E/CDK2 とサイクリン D/CDK4/6 などのサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のシリーズで関連の遺伝子式4,10。Rb は、小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲)11,12,13で変更でした。
相撲は、様々 な標的タンパク質に共有されているユビキチン様タンパク質です。それは細胞周期制御を含む多様な細胞プロセスのために重大、転写、タンパク質局在と劣化、トランスポート、および DNA 修復14,15,16,17,18.、相撲活用経路から成っている二量体相撲 E1 活性化酵素 SAE1/UBA2、単一の E2 抱合酵素 Ubc9、複数の E3 リガーゼ、相撲特定プロテアーゼ。一般的に、成熟したフォームを生成する生初期の相撲の蛋白質を処理しなければなりません。成熟した相撲は E1 ヘテロダイマーによって活性化し、E2 酵素 Ubc9 に転送します。最後に、相撲の C 末端のグリシンは、基板ターゲット リジンに共役したし、このプロセスは通常 E3 リガーゼによって促進されます。SUMO タンパク質は、特定のプロテアーゼによって変更された基板から削除できます。本稿の著者による前の調査では、Rb の sumo 化に対して、G1 期は細胞周期進行13に必要なプロセスにおけるハイパー リン酸化につながる CDK2、バインディングを増加することを明らかにしました。我々 はまた、Rb sumo 化の損失が減少した細胞の増殖を引き起こすことを示した。また、最近 Rb sumo 化を保護すること Rb タンパク質プロテアソーム売り上げ高からこうして細胞19Rb 蛋白のレベルを上げることが示された.したがって、sumo 化は、様々 な細胞プロセスの Rb 機能に重要な役割を果たしています。Rb sumo 化の生理学的な関連性と機能的な結果の研究をするひと細胞または忍耐強いティッシュで Rb の相撲状態を分析する手法を開発することが重要です。
Sumo 化リバーシブル、非常にダイナミックなプロセスであります。したがって、通常完全に内因性の条件下で相撲修正された蛋白質を検出することは困難です。内因性 Rb sumo 化を検出する手法を提案します。さらに、それは、その相撲欠損変異11および野生型 Rb の外因性の Rb sumo 化を検出する方法を示します。特に、ジェイコブスらは Ubc9 融合監督 sumo 化 (UFD)20によって指定された基質の SUMO 化を増加させる方法を説明します。この方法に基づき、この議定書は Rb の強制 sumo 化とその機能の結果を分析する方法をについて説明します。相撲基板の何百もを以前に記載されているより多くの推定される相撲基板が多くプロテオミクスに基づく試金から識別されている、このプロトコルはひと細胞のこれらの蛋白質の SUMO 化を分析する適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、検出し、人間の細胞の Rb 内因性 sumo 化を分析するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、グローバル相撲関連信号の任意の交替なしの内因性の Rb タンパク質に重点を完全に自然な生理学的な状況下で Rb SUMO 化を調査するための重要なツールです。
この目的を達成するため、留意することが重要です、: 1) 相撲ユビキチン化と比較して 4 つの?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、科学と技術委員会の上海 (許可番号 14411961800) 国家自然科学基金、中国の (許可番号 81300805) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
Referências
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