Karakterisere celle migrasjon tredimensjonale In Vitro sår miljøer

Summary

Målet med denne protokollen er å vurdere effekten av pro – og anti – migratory faktorer på celle migrasjon i en tredimensjonal fibrin matrise.

Abstract

Foreløpig mest i vitro modeller av sårtilheling, som veletablerte scratch analyser, involverer studere celle migrasjon og såret nedleggelse på todimensjonale overflater. Fysiologiske miljøet som i vivo sårheling foregår er imidlertid tredimensjonale i stedet for todimensjonal. Det blir stadig klarere at cellen atferd varierer sterkt i todimensjonale og tredimensjonale terreng. Derfor er det behov for mer fysiologisk relevante i vitro modeller for å studere celle migrasjon atferd i såret nedleggelse. Metoden beskrevet her kan for studier av celle migrasjon i en tredimensjonal modell som bedre gjenspeiler fysiologiske forhold enn tidligere etablert todimensjonal scratch analyser. Formålet med denne modellen er å evaluere celle utvekst via undersøkelse av celle migrasjon fra en formet kropp i en fibrin matrise i nærvær av pro – eller anti – migratory faktorer. Bruker denne metoden, celle utvekst fra formet kroppen i en tredimensjonal matrise kan observeres og er lett kvantifiserbare over tid via brightfield mikroskopi og analyse av formet kroppen området. Effekten av pro-vandrende og/eller hemmende faktorer på celle migrasjon kan også vurderes i dette systemet. Denne metoden gir forskere med en enkel metode for å analysere celle migrasjon i tredimensjonale såret forbundet matriser i vitro, dermed øke relevansen av i vitro celle studier før bruk av dyr i vivo modeller.

Introduction

Sårheling er en kompleks prosess som resulterer i restaureringen av vev integritet etter skade. Denne prosessen er delt i fire overlappende stadier omfattes av hemostasen, betennelse, spredning og remodeling, som hver reguleres av en kompleks kombinasjon av løselig Stikkordene, celle-matrix interaksjoner og celle-celle kommunikasjon. ^{1 , 2} orkestreringen av disse stikkordene styrer en rekke mobilnettet svar i sårheling viktigere, inkludert celle migrasjon. ^{3 , 4} celle migrasjon er en svært dynamisk prosess avhengig både mobilnettet fenotyper og egenskapene biokjemiske og Biofysiske ekstracellulær matrix miljøet. ⁵ celler kontinuerlig undersøke ekstracellulær matrix miljøet gjennom integrin-mediert baner; Denne prosessen kan celler å kjenne en rekke matrix egenskaper inkludert topografi, stivhet og confinement. Todimensjonal (2D) analyse av celle migrasjon viser at overføringen er drevet av lamellipodia formasjon i forkant gjennom generasjon begrepsordbok filament bunter. Påfølgende dannelsen av fokal adhesjon i forkant, i kombinasjon med actomyosin drevet sammentrekning og retraksjon på etterfølgende kanten, kjører cellen frem. ⁶ tredimensjonale (3D) mobilnettet overføring er for øyeblikket ikke godt forstått, men studier viser at 3D-overføring er ganske annerledes enn den tidligere beskrevet mekanisme i 2D og er trolig drevet av alternative mekanismer. For eksempel, studier av Petrie et al. viste at avhengig av egenskapene til ECM, celler i 3D matriser kan veksle mellom lamellipodium og lobopodium drevet mekanismer for overføring. ⁷ celle migrasjon er en kritisk komponent i såret healing respons, 3D-modeller av celle migrasjon er avgjørende for å forstå fysiologiske responser på ulike stimuli under sårtilheling. Selv om cellen vandrende atferd på 2D flater har vist å variere fra migrasjon i 3D matriser, benytte nyeste i vitro modeller av celle migrasjon under såret helbredelsesprosessen, inkludert veletablerte scratch analysen, 2D monolayer kulturer. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} mer nylig utviklet analyser har benyttet en 3D matrix, men fortsatt kultur celler i en monolayer over matrise, dermed begrenser muligheten til å virkelig recapitulate three-dimensionality av cellen miljøet i vivo. ¹⁵

Formålet med metoden beskrevet her er å studere celle migrasjon i en fysiologisk relevante 3D-modell, og ikke på 2D underlag, for å få en mer robust forståelse av migrasjon svar forbundet med anvendt stimuli. Denne metoden tillater for vurdering av celle migrasjon i en 3D fibrin blodpropp matrise i nærvær av faktorer som aktivere eller hemme trasé tilknyttet celle migrasjon. En fibrin matrise ble valgt for denne metoden på grunn av den viktige rolle fibrin spiller i de tidlige stadiene av sårheling; følgende skade, en fibrin blodpropp dannes i såret miljøer å demme blodtap og fungerer som et stillas for første celle infiltrasjon tissue reparasjon og ombygging. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} i tillegg fibrin brukes klinisk som en kirurgisk tetningsmasse og sammensetningen av Forseglinger har vært knyttet til celle migrasjon og ultimate healing resultater. En tidligere studie av Cox et al. undersøkt fibroblast overføring med fibrin clots består av varierende fibrin og trombin konsentrasjoner for å optimere en fibrin fugemasse. I disse studiene, ble migrering av celler av fibrin clots på plast retter kvantifisert. ²⁰ Her presenterer vi en metode som gir mulighet for kvantifisering av migrering av celler i 3D fibrin miljøet. Mens metoden beskrevet i denne protokollen spesielt bruker fibrin, kan denne modellen enkelt endres for å bruke alternative matrix materialer som ønsket, for eksempel kollagen eller andre 3D matriser. I tillegg presenterer vi bruk av fibroblast spheroids i denne analysen fordi fibroblast overføring til såret sengen er av overordnet betydning for ekstracellulær matrix syntese og vev reparasjon/ombygging. Men under reparasjon er prosessen nøytrofile den første celle typen overføre til såret sengen, etterfulgt av makrofager. Fibroblaster da begynne å infiltrere såret miljøet ca 48 timer etter første skade, i begynnelsen av proliferativ fase av såret helbredelsesprosessen. ¹⁹ denne analysen kan enkelt endres for å inkludere nøytrofile og makrofager andre celletyper å vurdere hvordan endringer i fibrin blodpropp struktur påvirker migrering av disse celletyper. ²¹

For å implementere denne analysen, først, er en fibroblast-formet dannet ved hjelp av en endring av teknikkene tidligere for stamcelleforskningen kultur. ²² fibroblast-formet overføres senere til en 3D fibrin matrise, og resultatet deretter lett kan overvåkes og kvantifisert over flere dager. Denne protokollen tar hensyn 3D fysiologiske systemer ved å bygge inn 3D celle spheroids i en fibrin matrise, dermed unngår begrensningene i relevans forårsaket av en bruker en 2D vekst overflate med en celle monolayer modell vandrende virkemåten, mens gir for evalueringen av cellen atferd i kontrollerte i vitro omgivelser.

Protocol

1. dag 1: cellen og forberedelse av reagenser Merk: alle cellen og reagens forberedelse skal utføres i en biologiske sikkerhetskabinett kabinett for å unngå forurens av prøvene. Varm filtrert Dulbecco ' s endret Eagle ' s Medium (DMEM), fosterets bovin serum (FBS), L-glutamin og penicillin/streptomycin i et 37 ° C vannbad. Forberede neonatal menneskelige dermal fibroblast (HDFn) media ved supplere varmet DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 1% L-gl…

Representative Results

Spheroid kultur kan benyttes for å kunne evaluere effekten av pro og anti-migratory på fibroblast overføring i vitro3D fibroblast spheroids kan dannes via hengende slipp kultur løpet av 72 h (figur 1). Etter kultur perioden, spheroids er innebygd i blodpropp matrix og fotografert bruker brightfield mikroskopi (figur 2). Første spheroids (avbildet i figuren som områder som er avgrenset av de hvite kantli…

Discussion

Denne protokollen gir undersøkelse av celle migrasjon i sårheling forbundet ECMs gjennom en i vitro 3D modell. Et avgjørende skritt i riktig utførelse av prosedyren er riktig utvikling av fibroblast spheroids; cellen konsentrasjon under forberedelse var optimalisert for å gi en innledende konsentrasjon av 2500 celler/slipp, slik at spheroids skjemaet pålitelig over en inkubasjonsperiode 72 h. Hvis et tilstrekkelig antall celler, spheroids kan ikke samlet effektivt og kan bryte fra hverandre ble overført o…

Materials

Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes